斑马鱼对强光刺激的惊恐逃避反射试验

惊恐反射是一种由视觉、听觉或嗅觉诱导的生理反应。正常斑马鱼在经过一段时间的适应后，如其所在区域中的光线、声音或气味等因素突然发生变化，会本能地做出一种迅速地逃脱该区域的动作。斑马鱼的惊恐反应于68 hpf产生，斑马鱼的眼睛正在形成且视网膜神经元突触也正在建立，而发育至 96 hpf 后，幼年斑马鱼具有自由运动的能力。因此，可通过对光照刺激引发的惊恐反应能力和刺激撤除后行为恢复能力变化的观察，检测由视觉引发的感觉运动高级神经回路是否正常。

惊恐反射试验时间为斑马鱼白天活动平台期，在转移至黑暗环境中适应一段时间后，斑马鱼幼鱼表现为静息或平稳游动。如果突然给予强光照射，正常幼鱼对外界刺激的反应表现迅速静止不动或速度明显降低。而撤除光源后，幼鱼表现为最初表现为运动活跃后又逐渐减慢。为检测化合物暴露后幼鱼对环境中光线突然变化时的反应以及对光暗周期性交替变化的适应能力，进行3次光、暗交替变化，以光线变化时刻前后 1min 内速度变化以及光、暗期内平均移动距离等参数作为神经行为学评价指标。另外，应用幼鱼运动行为仪和相关软件的基础上采用的视频采集、图像跟踪技术进行高通量的检测。

将48孔板放入幼鱼运动行为仪内适应5min后，控制幼鱼运动行为仪采集幼鱼运动视频，其中前5 min为黑暗期，第6min通过FishTrack软件（上海欣软）编程控制行为仪开启底灯强光照射1 min后迅速关闭，5min后结束视频采集。应用FishTrack软件（上海欣软）导出观察期内每条幼鱼每1min平均运动速度和运动距离等参数。实验同时设正常对照。实验时段白天为12:30~15:30，夜间18:30-20:00。通过比较光照前后不同剂量组幼鱼的速度变化，以及在光照结束后恢复期内运动距离的变化，评价暴露对幼鱼惊恐反射活动的影响，判断幼鱼的视觉或感觉运动高级神经回路的损伤作用。

数据分析

应用FishTrack软件（上海欣软）编程实现间隔5min的光暗交替，导出每1min幼鱼的平均移动速度和5min光暗期内的总体平均移动距离等参数，通过分析光暗交替时运动速度的变化以及在光暗周期内运动距离的变化，可给予药物或化合物评是否能够改变幼鱼对惊恐刺激的反应及适应能力。

幼鱼惊恐反射试验反应能力和暗适应能力的变化（A:光暗交替时刻前后1min内速度变化; B:光暗期内每min移动距离）

各剂量组幼鱼在暗-光交替时刻加速度的变化，呈兴奋和抑制的两种反应效应。例如：给予斑马鱼醋酸铅0.01μM ~0.1μM 组随暴露剂量增大，对突发强光的反应表现为逐渐兴奋，而 0.5μM 组的反应同对照相似表现为抑制性运动；在光-暗交替时，除 0.5μM 暴露组外幼鱼运动主要表现为兴奋效应，但加速度随剂量增加逐渐降低，对暗环境的兴奋性反应降低逐渐扭转到 0.5μM 的抑制性反应。运动能力比较发现，在光照前的暗适应期内幼鱼的平均运动距离呈剂量依赖性“U”型反应，以 0.05μM 最低。在光照期内各剂量暴露组的差别不显著，在光照后进入黑暗环境后整体表现运动能力低于正常对照组，同样以 0.05μM 降低最明显。