斑马鱼：线粒体与免疫系统的关系

摘要：线粒体是细胞器，通常与通过氧化磷酸化 (OXPHOS) 过程形成三磷酸腺苷 (ATP) 相关。然而，线粒体也负责钙稳态、凋亡、自噬和活性氧（ROS）的产生等功能，这些功能共同导致不同的细胞命运。线粒体形态的变化依赖于营养素的可用性和细胞的生物能量需求，这一过程称为线粒体动力学，包括融合和分裂。这种细胞器感知微环境，并能将细胞修饰成促炎或抗炎状态。斑马鱼越来越多地被用于研究线粒体动力学及其与免疫系统的联系，因为参与这些过程的途径和分子是相对保守的。目前有几种基因工具和技术可用于分析斑马鱼线粒体。尽管斑马鱼呈现出哺乳动物已知的几种类似过程，但在该模型中，线粒体在免疫系统中的作用尚未得到广泛的研究。本文总结了斑马鱼线粒体功能和免疫代谢研究中的最新知识。

关键词：线粒体  线粒体功能  新陈代谢  免疫学  免疫代谢  斑马鱼

简介：线粒体被称为“细胞的发电站”，因为其主要功能是通过三羧酸（TCA）循环中代谢产物的氧化产生能量，最终在电子传递链（ETC）中合成ATP。在这个过程中，丙酮酸或脂肪酸被丙酮酸脱氢酶（PDH）氧化为乙酰辅酶A，然后乙酰辅酶A与草酰乙酸形成柠檬酸。TCA 循环合成 FADH2 和 NADH，负责为 ETC 提供电子，ETC 反过来将这些电子转移到分子氧，同时将质子泵送穿过线粒体内膜。这一过程产生了质子驱动力，通过ATP合成酶复合物生成ATP。

线粒体代谢：细胞与线粒体之间的信号转导机制有多种，如顺行和逆行信号。逆行信号从线粒体到细胞质，主要表现为线粒体活性氧（mtROS）的产生，包括过氧化物、超氧化物和羟基自由基等。ETC位于线粒体内膜，具有四个电子传递复合物和ATP合成酶。它可以通过复合物I和III合成超氧化物，这些超氧化物可以进一步被超氧化物歧化酶（SOD）转化为过氧化氢并释放到细胞质中，过氧化氢可以引起蛋白质硫醇基团的氧化。一项有趣的研究调查了恒温鱼类和变温鱼类线粒体代谢功能之间的差异。由于恒温鱼类保持接近21°C的温度，并不断游泳呼吸，因此表明线粒体在补充肌肉收缩所消耗的ATP方面起着重要作用。因此，除了有氧代谢产生ATP外，还有活性氧的合成。另一方面，先前已经表明，与大鼠的线粒体速率相比，变温鱼在分离的线粒体中具有较低的过氧化氢流出量。由于 ROS 的产生会加剧组织损伤，因此假设随着鱼类出现保温现象，开发了一种补偿机制来最大限度地减少这些影响。然而，与研究的变温鱼类相比，该研究没有发现太平洋蓝鳍金枪鱼这种鱼类的补偿机制。在哺乳动物和鱼类中同样产生的线粒体ROS可调节缺氧诱导转录因子1（HIF-1）的激活，HIF-1在细胞适应低氧水平方面起着重要作用。脊椎动物具有三种功能性 HIF-1α 异构体：HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α。HIF-1 由两个亚基组成，氧调节亚基 (HIF-1α) 和组成型表达亚基 (HIF-1β)。HIF-1α 在代谢、线粒体功能、炎症细胞募集等生理表型中的作用已被定义。在斑马鱼和其他硬骨鱼中，由于进化过程中的全基因组重复事件，每个 HIF-α 异构体都有两个拷贝。一项调查 hif1aa 和 hif1ab 对线粒体调节作用的研究表明，这两种旁系同源物都提供不同的功能：hif1aa负责调节Ca2+浓度、ROS产生、柠檬酸合成酶的转录水平以及线粒体膜电位的增加，而hif1ab通过增加复合物I、III和IV的活性以及促进ATP生成来促进OXPHOS。此外，hif1aa和hif1ab都促进线粒体生成。线粒体的其他逆行信号功能包括通过改变 TCA 循环中间体（如琥珀酸、乙酰辅酶 A、α-酮戊二酸和富马酸）的可用性来影响信号通路。另一方面，线粒体可以通过从细胞质到线粒体的顺行信号与细胞通信。可以看到响应于细胞质高钙水平的顺行信号，这导致钙快速整合到线粒体基质中。钙的流入可以调节 OXPHOS 并通过激活来自 TCA 循环的脱氢酶来影响耗氧量和 ATP 的形成。这也导致线粒体一氧化氮合酶 (mtNOS) 产生一氧化氮，该酶通过对细胞色素氧化酶的竞争性抑制来调节耗氧率。这种负反馈机制允许氧气向细胞的其余部分流动。另一项研究表明，钙内流增加了复合物 I、III、IV 的电导、ATP 生产/运输在骨骼肌细胞中的作用，进一步支持 Ca2+ 激活该途径的观点。有一些关于斑马鱼毛细胞钙吸收和钙内流的研究。众所周知，Ca2+ 是一种重要元素，尤其是对脊椎动物而言。 在陆生脊椎动物的情况下，这种元素的主要来源是食物，肠道是其吸收的主要场所。显然，水生动物的环境容易受到水中不同浓度Ca2+的影响。因此，鳃成为鱼类吸收Ca2+的主要场所。然而，在鱼类早期胚胎和仔鱼中，钙的吸收主要通过富含线粒体的皮肤细胞。

线粒体与斑马鱼免疫系统：斑马鱼免疫系统显示出不同的时间激活，，其中先天免疫系统在受精后48小时（HPF）处于激活状态，而适应性免疫系统在受精后4-6周（wpf）左右完全成熟。斑马鱼和人类细胞的成熟不同：哺乳动物造血干细胞 (HSC) 在卵黄囊中发育，然后在骨髓中发育，而斑马鱼HSC 在背主动脉的腹侧内皮细胞上发育，然后迁移到后主静脉，移动到尾侧造血组织 (CHT)，大约 48 hpf开始增殖。然后HSC从 CHT 移动到前肾和胸腺，到受精后第六天（dpf），造血干细胞迁移到其最终和确定位置：肾骨髓。适应性免疫系统的发育在 3 dpf 左右开始，具有 V(D)J rag1-2 依赖性机制，但T细胞和B细胞在受精后4-6周 (WPF) 被激活和循环。此外，斑马鱼 B 细胞不进行类别转换，仅表达 IgM、IgD 和 IgZ/T 亚型。第一个先天免疫细胞和第一个适应性免疫细胞出现之间的时间距离允许对斑马鱼免疫系统进行划分。

免疫系统由一系列特化细胞类型组成，这些细胞类型可以响应来自病原体和宿主本身的各种危险信号，以维持体内平衡。同样，这些细胞的新陈代谢也需要适应，响应底物的可用性和每个细胞不断变化的代谢需求，以执行其效应功能。在炎症和感染环境中先天性免疫细胞，特别是巨噬细胞和中性粒细胞的细胞代谢对特定组织的功能已被广泛研究。巨噬细胞是高度可塑性的细胞，由大量异质性细胞组成。它们的主要功能是识别与损伤及病原体（分别为DAMPs和PAMPs）相关的分子模式，通过合成活性氧和吞噬机制清除病原体，清除细胞碎片和产生细胞因子。在斑马鱼感染的情况下，线粒体 ROS 的产生是必不可少的，海洋分枝杆菌感染的情况下，巨噬细胞 ROS 的产生增加。因此，一旦被 TNF-α 诱导，就会激活坏死途径。从这个意义上说，mtROS 的产生可以通过 MitoTracker Red CM-H2Xros 进行评估，因为氧化后的线粒体会发出红色荧光。此外，它们可以促进作用于组织重塑的分子的合成，从而导致组织再生、修复或纤维化。激活后，这些细胞可能表现出不同的形态，这取决于它们所处的微环境。在体外模型中，当受到IFN-γ或脂多糖（LPS）刺激时，M0巨噬细胞极化为促炎性巨噬细胞（也称为M1）或典型激活，而当受到细胞因子（如IL-4或IL-13）刺激时，巨噬细胞转化为抗炎或促分解表型（M2）。此外，巨噬细胞极化可以通过细胞内信号、可溶性蛋白和转录因子进行调节，例如当 Toll 样受体信号激活信号转导和转录激活因子 (STAT) 1 蛋白时，可导致巨噬细胞向M1样表型发展。尽管这是一个有点过于简单的命名法，但它是研究代谢和其他生物过程的一种手段，并将其与这些细胞的表型特征相关联。这种极化过程在硬骨鱼中也有描述，其特征是诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶2（Arg2）分别作为M1和M2样细胞的标记。有趣的是，已经进行了体外研究，哺乳动物LPS受体TLR4可能在这些鱼类中不起作用。由于这种微生物刺激物被认为是一种重要的免疫刺激物，因此可以通过不同的机制感知LPS。重要的是，哺乳动物保留单个IFN-γ分子，这些分子对极化为M1巨噬细胞很重要。相比之下，许多硬骨鱼表现出多种IFN-γ，它们具有不同的作用，一些诱导产生严格意义上的ROS，但不产生一氧化氮（NO），而另一些诱导产生NO和有限的 ROS。促炎巨噬细胞使用糖酵解、戊糖-磷酸途径 (PPP) 和脂肪酸合成进行代谢程序。与M0细胞相比，M1巨噬细胞的耗氧量减少，表明其对线粒体代谢的依赖性较小，ATP的合成主要通过糖酵解进行。与此相反，抗炎巨噬细胞除了FAO、谷氨酰胺分解和色氨酸分解代谢外，还具有增强的氧磷代谢。

斑马鱼线粒体代谢与免疫系统的关系：线粒体代谢过程与炎症反应和组织损伤有关。组织损伤后，炎症反应被触发，血液白细胞通过内皮细胞进入损伤区域。首先参与炎症反应的细胞是中性粒细胞，其次是巨噬细胞，它们具有通过胞吐作用清除周围碎屑的功能。线粒体中的生物过程参与吞噬作用，特别是通过线粒体膜蛋白（UCP）去耦蛋白2的参与。Park及其合作者的一项研究表明，Ucp2的缺失降低了小鼠巨噬细胞的吞噬能力，Ucp2表达的增加与巨噬细胞吞噬能力的增加有关。硬骨鱼鲫鱼在酵母聚糖试验种表现出独特的反应。稳态期间循环白细胞的总分数中含有<5%的中性粒细胞，但当该动物模型受到应激时，中性粒细胞占50%。在这项研究中，在注射后18和48小时分离中性粒细胞，时间点分别相当于促炎症和促分解阶段。有趣的是，这些细胞表现出不同的表型，促炎症阶段细胞释放白三烯B4并促进巨噬细胞ROS的产生。相比之下，在促分解阶段细胞产生低水平的 ROS，释放脂氧素 A4，这是一种促分解脂质介质，有助于巨噬细胞摄取凋亡细胞。由 Drp1 蛋白介导的线粒体裂变在胞吞作用过程中也是必需的。 Drp1 诱导内质网释放钙，这是巨噬细胞形成吞噬体和消除凋亡细胞所必需的过程。因此，线粒体裂变使巨噬细胞能够消除几个凋亡小体，并避免不消除这些凋亡残留物的病理后果。 胞吞作用失败可导致重要疾病，如自身免疫性疾病和动脉粥样硬化。

通过硬骨鱼研究评估了 M1 和 M2 巨噬细胞在基础和应激条件下的代谢。通过实时测量耗氧量和乳酸酸化，发现M1巨噬细胞除了改变糖酵解途径外，还增加了一氧化氮的合成和免疫反应基因1（irg1）的表达。在 M2 巨噬细胞中，精氨酸酶活性增加，糖酵解和 OXPHOS 途径与对照组相似。结果表明代谢变化与不同的巨噬细胞表型有关，类似于哺乳动物。涉及斑马鱼 irg1 的研究揭示了感染期间免疫细胞的葡萄糖和脂质代谢的变化。在对鼠伤寒沙门氏菌感染的反应中，巨噬细胞表现出irg1的表达增加，irg1是一种线粒体相关酶，可诱导脂肪酸分解代谢以维持OXPHOS，从而产生mtROS。有助于在吞噬过程中杀死细菌，表明该酶是免疫代谢轴的关键组成部分，与感染、细胞代谢和巨噬细胞效应功能相关。在斑马鱼肺结核模型中，过量的 TNF 诱导受感染巨噬细胞中 mtROS 的形成，增加其杀微生物活性，但也诱导坏死，使分枝杆菌释放到细胞外介质中。该途径由线粒体亲环蛋白 D 和酸性鞘磷脂酶介导的神经酰胺产生激活。 当这条通路被化学抑制时，效果就会逆转。这暴露了斑马鱼在线粒体相关条件下进行治疗性化合物测试的潜力。线粒体是细胞凋亡和炎症的信号中心，导致以 ETC 副产物形式产生 mtROS，进而对细胞信号通路产生显著影响。Peterman 等人证明了抗氧化酶 SOD2 在调节斑马鱼仔鱼 mtROS 中的作用。响应铜绿假单胞菌的感染，sod2 缺陷斑马鱼表现出更大的细菌负荷，增加死亡率，并减少吞噬细胞的数量，表明 sod2 通过保护巨噬细胞和中性粒细胞免受超氧化物线粒体的负面影响来增加先天免疫功能。关于线粒体代谢在免疫系统细胞性能中的作用仍有很多需要评估。像斑马鱼这样的活体模型可以成为这一领域的有力工具，为生理和病理背景下线粒体功能的研究提供答案。

结论：斑马鱼的线粒体功能也与免疫功能有关，与巨噬细胞有关。与哺乳动物类似，斑马鱼的巨噬细胞在一氧化氮合成、糖酵解和 OXPHOS 途径中具有不同的代谢设置，增加了 mtROS 的产生以应对感染。mtROS 的产生与抗氧化酶 SOD2 相关，而 SOD1 与中性粒细胞运动相关。根据目标了解每种模型和技术组合的优缺点非常重要。这些工具的开发和改进将帮助研究人员改进斑马鱼线粒体研究，并为分析线粒体功能障碍和疾病创造新的选择。