微生态制剂概念及其在水产养殖中应用的一些问题

近年来，由于水产养殖环境和自然环境污染的日趋严重，导致养殖生物病害发生日趋严重，给水产养殖业带来巨大损失。在水产动物病害防治方面，目前广泛使用的鱼用消毒剂、抗菌药、杀虫药物存在不同程度的消毒不稳定、产生耐药性、残留量大或污染环境等问题。随着人们健康环保意识的加强，微生态制剂因被认为属于无毒副作用、无残留污染的产品而得到越来越多的关注。

1微生态制剂的概念

1.1微生态制剂与微生态系

微生态制剂是指在微生态理论指导下，运用微生态学原理，利用对宿主有益无害的、活的正常微生物或正常微生物产生的促生长物质经过特殊工艺制成的制剂，以达到调整机体微生态平衡的目的（赵明军和谌南辉，2002）。益生菌是微生态制剂的一个类别，在国内又译成益生素、益生剂、生菌素、促生素、生菌剂、益菌剂等。Probiotics一词源于希腊文，是“共生”的意思，意味着“在动物之间的生命维持上起到相互补益的作用。其现代定义最早在1965年被Lilly和Stillwell阐述为“由一种微生物分泌刺激另一种微生物生长的物质”。此后，随着对益生菌研究的深入，益生菌的定义也屡次被修订。在国内，一些学者也从不同角度对益生菌作了修订和定义（陈廷柞，1997；章剑，2000；王士长等，1999）。目前普遍认同Fuller在1989年提出的概念：益生菌是添加于饲料中，通过改善动物肠道微生物平衡而对其发挥有利影响的微生物活体。

微生态是指人、动物、植物体中的正常微生物群及其相互之间的关系（薛恒平和薛彦青，1997）。在一定的空间结构内，正常微生物群，以其宿主人类、动物、植物组织和细胞及其代谢产物为环境，在长期进化过程中形成能独立进行物质、能量及基因相互交流的统一的生物系统，称之为微生态系（康白，1996）。保持宿主的微生态平衡，宿主才能保持正常生长发育（薛恒平和薛彦青，1997）。

1.2微生态制剂的种类

动物微生态制剂按其用途和作用分为微生态饲料添加剂和微生态调节剂（李慧昕和李金龙，2003）。微生态饲料添加剂是指直接饲喂动物的活菌制剂，多以乳杆菌、蜡样芽孢杆菌等为主，用于畜禽育肥、抗病。微生态调节剂是指用于调整失去平衡的菌群达到治疗疾病的一类微生态制剂，多采用乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌、酵母菌等，在治疗消化道疾病，尤其是幼龄动物下痢方面效果显著。微生态制剂按照微生物的种类又可分为：芽孢杆菌制剂、乳酸菌制剂、酵母类制剂、双歧杆菌制剂、拟杆菌制剂等（赵明军和谌南辉，2002）。在水产养殖中，微生态制剂则可分为饲料微生态添加剂和水质微生态调节剂（葛芹玉，2001）。

1.3微生态制剂的作用机理

微生态制剂被摄入动物体肠道后，在复杂的微生态环境中与近400种正常菌群汇合，表现出栖生、偏生、竞争或吞噬等复杂的关系，改变生物体内的微生物群落，促进宿主动物的健康（章剑，2000）。但是，与抗生素相比，其作用机理在理论上进展还很小。现对其主要作用机理简要概述如下：

1.3.1益生菌分泌物

很多研究结果表明，大部分益生菌能够分泌某些物质，以抑制或杀死周围其他异种菌群，人们把这些物质统称为细菌素。一般认为，它可以是益生菌与其他菌种竞争而释放的抑菌物质，也可以是其本身的代谢物质，抑或二者兼而有之。Ring和Gatesoupe（1998）认为，细菌素是一种特异性的复合物，乳酸菌细菌素的有效成分是过氧化氢、有机酸以及它们所分泌的乳酸。这与 Lewus （1991）、Helander等（1997）的结论相似，也与陆上动物益生菌细菌素的研究结论相仿。但是，其他研究也表明，细菌素并不都是这些物质，除此之外还有生物表面活性剂、羊毛硫抗生素、铁载体，甚至各种短肽：如乳酸链球菌肽、肽聚糖等。

1.3.2竞争抑制

竞争抑制是微生态制剂的重要作用机制，在水产动物体内，微生态制剂对病原菌的竞争性抑制，大致可分为占位抑制与营养抑制。（1）在益生菌所有的生物效应中，与病原菌竞争附着点可能是益生菌进入体内后发挥的第一个作用。通过对体内固定位点的竞争，使微生态制剂的数量和密度增加，病原菌的数量和密度降低，起到防病害的作用。如乳酸杆菌在肠道内迅速生长，和肠道上皮细胞黏附受体竞争吸附，并竞争生长环境中的营养成分，从而抑制病原菌生长（Parmod and Jhari，1998）。（2）当饲料中营养素缺乏时，益害菌之间对有限营养素的竞争利用便也成为彼此相互抑制的重要方面。益生菌通过更有效地利用有限的营养素而导致病原菌营养缺乏，并以此使自身在竞争中取得胜利。

1.3.3免疫作用

微生态制剂的作用机制除了直接的抑菌作用之外，还对远离消化道的免疫系统产生影响。微生态制剂是良好的免疫激活剂，能有效地提高干扰素和巨噬细胞的活性，通过促进B细胞产生抗体和提高噬菌作用活性等刺激免疫力和抗病能力（周利梅，2000）。Yasui等（1992）报道双歧杆菌的一些菌种具有刺激免疫系统，促进Peyer’s结淋巴细胞的增生，诱导产生SIgA，增强动物免疫功能的作用。

在陆生动物中所进行的一系列实验表明，动物体内的益生菌群的存在可以增强动物自身的免疫力，其免疫指标如巨噬细胞、免疫球蛋白、抗体等都与益生菌群有着密切的相关性。但与陆生动物相比，水产动物这方面的研究还比较缺乏（桂远明等，1994；黄永春等，1997；孙舰军和丁美丽，1999；Siriratet al.，2000）。然而，也有文献报道并未发现益生菌有促进免疫的作用（杜震宇等，2002）。

1.3.4生物夺氧

水产动物肠道内的正常菌群以厌氧菌为主。当微生态制剂中的菌种以孢子状态或其它活菌形式进入动物消化道后生长繁殖，消耗肠内的氧气，使局部环境的氧分子浓度降低，氧还原电势下降，造成厌氧环境，有利于专性厌氧菌的定植和生长；而需氧菌和兼性厌氧菌比例下降，使肠道内正常微生物之间恢复平衡状态，达到治病目的（叶成远和张惠云，2000）。

1.3.5其他作用

Gatesoupe（1999）讨论了铁在益生菌抗病害作用中的地位。他认为益生菌的抑菌效果在某种程度上受到着铁载体（siderophore）的调节。弧菌E（VibrioE）抑制病原性弧菌P（VibrioP）与二者对于铁离子的竞争有一定关系，而荧光假单胞菌则通过分泌载体与鳗弧菌争夺游离铁离子，而起到抑制病原菌生长与附着的效果。

1.4微生态制剂在水产养殖业中的研究和应用

微生态制剂真正被重视并应用于养殖业是从20世纪60年代和70年代人类发现了抗生素的弊端之后才开始的。目前，国内外关于益生菌的研究，大部分都集中在畜禽业方面，有相当多的文献对畜禽的益生菌作了深入的报道（March，1979；Buenrostro，1983；Stutz，1984；周凤兰，1996）。我国对动物益生菌的研究开始于20世纪70年代。80年代初，康白教授和何明清教授对健康和有病畜禽肠道的12种正常微生物群进行了定性、定量和定位测定，提出了幼龄畜禽下痢的原因是肠内菌群比例失调的新观点，并在此微生态失调理论指导下研制出可以防治畜禽下痢的活菌制剂。1992年我国成立中国畜牧兽医学会动物微生态分会，并把动物益生菌制品及其应用技术研究列入国家“八五”重点科技公关课题，推动了益生菌制品的应用研究工作（郭兴华，2002）。而与畜禽业相比，水产动物益生菌的研究就少得多，无论是从数量还是在研究层次上都与畜禽业方面有较大的差距，并且真正意义上的商业产品的实践应用也只是1986年的事。所以，水产动物益生菌的研究尚处于起步阶段（杜震宇等，2002）。

水产动物与陆生动物生活环境的巨大差异造成了它们益生菌的较大差异。大多数水产动物的幼苗孵化后便直接暴露于水环境中，立即与水环境中的微生物发生关系，并且在它们的成长过程中，消化管与外界的直接相通，与外环境中的水和外界微生物群频繁接触，使得内环境并不稳定。因此，水生动物消化道内菌群的更替和定植，与陆生动物很不相同。在陆生动物的消化道中，往往革兰氏阳性菌占优势（Hume，1997），而在鱼类、贝类消化道中，往往能发现大量的革兰氏阴性菌（Clements，1997）。因此，与陆生动物相比，水生动物益生菌群在组成、变化甚至选择难度上都有着自身的特点。

与水产动物微生态制剂的基础研究相比，对微生态制剂在水产养殖实验中的实际效果的研究报道就相对较多。大致为：（1）可抵抗病害，提高动物在遭受病害侵袭时的存活率；（2）提供营养，促进生长；（3）提高饲料转化率。但是，也有极少的研究者对微生态制剂的添加效果提出质疑。Gildberg等（1997）的研究显示，在饲料中添加乳酸菌，对于大西洋大马哈鱼鱼苗的生长与存活率并没有表现出预期的效果。

目前，已有众多的益生菌产品应用于生产，但其中仍有许多急待解决的问题：（1）益生菌种缺乏，目前已确认可作为生产用的益生菌只有乳酸杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌等少数几种菌种；（2）活菌制剂在饲料加工、运输工程中容易失活；（3）生产用菌种往往难以达到足够的数量去发挥作用；（4）生产用菌株往往生长太慢，很难在与病原菌竞争过程中取得优势；（5）菌株的抗药性问题。

由于动物肠道菌群自身及与宿主、环境的关系错综复杂，目前对于微生态环境的控制与物质代谢的机制研究尚不深入。加强相关基础研究，同时加强新的加工工艺研究等，有利于微生态制剂更科学有效地应用于生产实践。

2 微生态制剂对动物免疫机能的影响及机理

已有文献不断报道微生态制剂对动物免疫系统具有促进作用。Fuller（1989）研究报道微生态制剂可以提高动物抗体水平和巨噬细胞活性，并提出微生态制剂对动物的非特异性免疫机能有促进作用。Inooka（1983）通过对纳豆芽孢杆菌的研究发现，纳豆芽孢杆菌可以影响鸡抗绵羊红细胞抗体的滴度；1986年他又用纳豆芽孢杆菌饲喂1-27日龄的全白来航公鸡，显著提高了鸡脾脏T、B淋巴细胞的百分率，因此，他得出纳豆芽孢杆菌对雏鸡的细胞免疫和体液免疫有影响的结论。国内也有学者报道，有益菌群可以作为抗原刺激机体，促进机体免疫机能成熟，提高宿主的生物屏障和机体免疫机能（陈联敏，1989）。潘康成等（1998）发现微生态制剂对家兔免疫器官的生长发育和成熟有促进作用，还可以增加白细胞和T淋巴细胞的数量，促进家兔的体液免疫功能。另外还有人研究证明了微生态制剂对鲤和中国对虾免疫功能有促进作用（吴垠等，1996）。

尽管国内外文献大量报道了微生态制剂对免疫系统的影响，但其机理仍不系统和确定。孟祥晨和霍贵成（2004）报道双岐杆菌免疫调节作用机理一方面是通过肠道的黏膜免疫引起系统性免疫应答，另一方面是通过双岐杆菌的易位作用。也有文献报道，芽孢杆菌为需氧菌，在生长过程中需要大量的氧气，进入体内以后，消耗大量的游离氧，降低氧化还原电势，有利于厌氧微生物的生长，保持肠道微生态系统平衡，提高机体抗病能力。潘康成等（1999）报道芽孢杆菌作为非特异性免疫因子，通过细菌本身或细胞壁成分刺激机体免疫细胞，使其激活，产生促分裂因子，促进细胞活力或作为佐剂发挥作用；此外，还可发挥特异性免疫功能，促进B细胞产生抗体。一些研究者认为微生态制剂的作用是与菌体结构、代谢产物以及调整微生物群有关。有研究发现微生态制剂对动物的免疫功能的影响与正常菌群的细胞壁成分有关（Sekine，1985）。Berger（1971）认为枯草芽孢杆菌促进机体的非特异性免疫是由于菌体在肠道分解营养物产生一种被称之为“Protodyne”的蛋白，经机体吸收后对机体防御机能刺激的结果。有研究结果表明，微生态制剂中许多有益细菌的细胞壁具有免疫活性，如：乳酸杆菌的肽聚糖、双岐杆菌的细胞壁粘肽、芽孢杆菌的细胞壁成分等，这类物质都具有刺激机体免疫系统，非特异性地提高动物免疫功能的作用。

3 肠道菌群对动物免疫的影响

3.1 鱼类肠道菌群概况

鱼类肠道内定植着种类较多、数量庞大的菌群。不同鱼类其肠道菌群组成各不相同。不同研究者及不同试验条件下研究的肠道优势菌群也不尽相同。Sakata等报道淡水鱼类肠道内专性厌氧菌以A、B型Bacteroides（拟杆菌属）等为主，Sugita等报道淡水鱼类肠道内好氧性和兼性厌氧细菌以Aeromonas（气单胞菌属）、Enterobacteriaceae（肠杆菌科）等为主。Mattheis（1964）分析鲤科鱼类肠道菌群主要为Pseudomonas（假单胞菌属）和Aeromonas。Sugita等（1985）对淡水养殖池中的罗非鱼、草鱼、鲤等肠道菌的研究指出，Vibrio（弧菌属）、Aeromonas是淡水鱼胃肠道中主要的兼性厌氧菌，主要的专性厌氧菌是A型和B型Bacteroides。周文豪（1997）报道了草鱼鱼种肠道菌群的优势菌群为 Aeromonas、Pseudomonas、Enterobacteriaceae等。李莉等（2002）报道草鱼肠道内优势菌群主要为Aeromonas、Entobacteriaceae、Vibrio和Corynebacterium（棒杆菌属）等。而海水鱼肠道菌群相对简单，主要为Vibrio的种类，且不易分离到专性厌氧细菌。杉田等（1982）将尼罗罗非鱼逐渐从淡水转入海水中饲养后，发现肠道内专性厌氧菌减少或消灭。

鱼类肠道菌群的数量与组成与鱼的种类、栖息水域、是否投饵、投饵时间、饵料种类和鱼体生理状况等因素有关（尾崎久雄，1985）。Sugita等（1983）报道淡水鱼肠道内细菌数量基本在 105-108cfu/kg之间，尾崎久雄（1985）报道海水鱼肠道内细菌数量在106～108cfu/kg之间。Margolis（1953）发现未投饵的16尾鲶鱼中，有15尾没有肠道细菌，未投饵的3尾红点鲑也没有，但摄食后2h的鱼就能检测到许多肠道细菌。陈孝煊（1996）报道草鱼饱食状态下肠道细菌数量平均为87× 106cfu/g，空肠状态下肠道细菌数量平均为7.29×106cfu/g。蒋长苗等（1992）比较草鱼正常菌群与肠炎病原菌关系时发现，发生肠炎的草鱼，点状产气单胞菌、大肠杆菌、肠球菌显著增加，而乳酸杆菌、双歧杆菌、厌氧菌与需氧菌比值显著下降。

3.2 肠道菌群与动物免疫的关系

目前，肠道菌群与动物免疫的关系仅在人和畜禽上有过报道，而关于水产动物这方面的研究尚未见系统报道。一般认为，肠道的免疫作用的产生依赖原籍菌群。当微生物菌群在新生儿期发展并延续整个生命的时候，微生物与宿主免疫系统的相互作用也开始进行（程茜和刘作义，2003）。肠道菌群重要的生理意义包括抵御病原体侵袭、刺激机体免疫器官的成熟、激活免疫系统及参与合成多种维生素、调节物质代谢等。

3.2.1 菌群屏障作用

动物的非特异性免疫应答，主要依靠机体的屏障作用，包括正常菌群、机体的皮肤黏膜、补体等体液因子、吞噬细胞等。其中，正常菌群的屏障作用是极为重要的一个方面（Vo11aard and C1asener，1994）。许多研究报道指出肠道菌群在人的肠道中起着生物屏障作用，可对外袭致病菌入侵、定居有拮抗作用。这种由肠道正常菌群提供的对致病菌和潜在致病菌在肠道中定植和增殖的抵抗性被称为定植抗力（张日俊，2002）。凡是有正常菌群存在的部位（包括皮肤表面、口腔、呼吸道黏膜等），都有正常菌群形成的定植抗力存在。缺乏定植抗力，动物肠道中的病原菌或潜在病原菌极易大量增殖，并突破肠黏膜进入组织中，最终导致全身感染，甚至因此而死亡。

3.2.2 促进免疫器官生长发育

益生菌能促进机体免疫器官的生长、发育、成熟，增加T、B淋巴细胞的数量，增加胸腺淋巴细胞免疫球蛋白含量。张日俊和万孟明（2003）用含有乳酸杆菌、芽孢杆菌和酵母菌的微生物饲料添加剂饲喂肉仔鸡，结果显示微生物饲料添加剂能明显刺激胸腺、脾脏和法氏囊的发育，增强鸡T淋巴细胞对丝裂原ConA或B淋巴细胞对丝裂原LPS刺激的反应性，增强了机体的细胞免疫和体液免疫功能。杨汉博和潘康成（2003）报道益生芽孢杆菌是一种很好的免疫增强剂，能促进肉鸡的免疫器官生长发育，提高机体的体液及细胞免疫功能，在提高机体的抗病能力方面具有很好的免疫学基础。

3.2.3 激活免疫因子

有研究报道，肠道菌群能明显激活巨噬细胞活性、促进细胞因子的分泌，增强免疫功能，提高宿主的抗病能力。在某些情况下，这些细胞因子可以代替免疫调节剂，刺激造血活性，增强成熟细胞的功能（赵燕飞等，2004）。Dinare11o（1989）研究发现，双歧杆菌能刺激免疫细胞分泌IL-1和IL-6，而IL-1又可促进T辅助细胞分泌IL-2和B淋巴细胞分泌抗体，也能增强NK细胞的杀伤功能；同时，IL-6可促进B淋巴细胞的分化成熟，使之分泌抗体，又可直接诱导T淋巴细胞的增殖并参与T淋巴细胞、CTL、NK细胞及LAK的细胞分化。双歧杆菌对T细胞的增殖和IL-2的产生没有直接作用，但能诱导TNF-α、IL-β、IL-6、IL-10和IFN-α的mRNA表达。

3.2.4 肠道菌群与肠黏膜免疫

肠道菌群是肠黏膜屏障的重要组成部分，包括其参与构成机械屏障、菌群和黏膜共价结合，与机体产生的酶、活性肽以及代谢产物共同组成化学屏障、免疫反应产生IgA、IgM及与各种免疫活性细胞和细胞因子等形成免疫屏障。肠道菌群对于肠道黏膜免疫的发生和成熟非常重要，肠道菌群可能影响体内免疫平衡。益生菌用于疾病治疗的机制可能有二种，一是益生菌能保持非免疫性肠黏膜屏障，主要指其增加肠道渗透性和改变肠道微生态；另一种是改善肠道免疫屏障，特别是通过肠IgA反应和缓解肠道炎症反应，从而保持肠道的稳定（程茜和刘作义，2003）。许多益生菌的作用都是通过免疫调节介导，尤其是对前炎性、抗炎性细胞因子平衡的控制。利用这些相应的作用机制，益生菌可以作为缓解肠道炎症，恢复黏膜功能，下调超敏反应的一种治疗新工具。正是由于肠道菌群在肠黏膜免疫方面的特殊作用，Grangette等（2001）将活的乳杆菌作为破伤风毒素黏膜疫苗的抗原递送系统，经鼻免疫，成功诱导了产生IgG抗体的特异性体液免疫反应和黏膜IgA抗体。这为益生菌开辟了新的应用前景。

此外，肠道菌群定植作用对于肠相关淋巴组织（GALT）的成熟是一种重要的抗原刺激。He1ge1and等（1996）研究结果表明，在定植作用方面，肠菌群不断向肠系膜淋巴结迁移，但迁移的细菌数量随着特异性IgA反应而减少，反映了肠道屏障机制的成熟。因此认为在肠相关淋巴组织发生的免疫反应，受控于肠道菌群的代谢活性和肠道菌群的平衡。Camerini等（1998）将外周淋巴结的淋巴细胞移植到重症联合免疫缺陷（SCLD）小鼠后，再分析其小肠上皮内淋巴细胞（iIEL）时发现，来源于胸腺的成熟T细胞可移行到小肠，在小肠环境中可分化为有特殊功能的IEL，但由于SCLD受体鼠的肠菌群减少，所以IEL数目很少，据此认为IEL的回归与位于固有层的肠道菌群抗原有关。（4）