在典型症状病鱼体内分离不到致病菌株的原因分析

在刚过去的十数年中，世界各国的科学家不约而同地开始关注到由于细菌耐药性（drug resistance）的快速蔓延，对人类健康形成的严重威胁问题。世界上的一些经济较为发达的国家，已经先后制定了旨在遏制细菌耐药性快速蔓延的“国家行动计划”等，正在行动起来为捍卫人类健康而奋斗。

国内、外的大量科学研究工作者利用微生物学的一些前沿新技术，开展了针对医院、畜、禽、水产养殖场和屠宰场收集的致病性细菌的抗微生物药物耐药基因（antibiotic resistance genes，ARGs）和毒力因子（virulence factors，VFs）传播热点问题的研究，通过利用宏基因组学等技术，分析、揭示了氨基糖苷类、林可酰胺类、四环素类和β-内酰胺类耐药基因的高多样性等一系列的科学问题，为控制抗微生物药物耐药性（antimicrobial resistance，AMR）传播，提供了重要策略与措施。

因为AMR已成为威胁21世纪人类健康的隐形杀手。据世界卫生组织（world health organization，WHO）估计，2019年细菌性AMR直接导致全球127万人死亡，并与近500万死亡病例相关。更令人担忧的是，世界银行（world bank）预测到2050年AMR将造成1.0万亿美元的额外医疗支出，到2030年每年可能导致1.0~3.4万亿美元的GDP损失。在这场人类与微生物的无声战争中，畜、禽、水产养殖场和屠宰场作为食品链中的关键节点，正悄然成为ARGs和VFs传播的温床。

从2008年开始，我们为了正确地诊治养殖鱼类疾病，科学、精准地使用水产用兽药，防止养殖鱼类致病性生物产生对水产用兽药的抗药性，先后在全国一些水产养殖区域协助当地水产养殖业者，建设了几十个“鱼病防控实验室”（图）。这些建设在全国各地的小型的实验室，在养殖鱼类疾病科学诊治过程中，发挥了很有意义的积极作用。

图：辽宁省沈阳市元丰饲料有限公司建设的鱼病防控实验室

根据部分实验室技术人员反馈回来技术咨询信息中，询问比较多的问题是，在部分已经呈现出典型疾病症状的患病养殖鱼类体内，为什么不能分离到致病性细菌菌株？为了给遇到这类问题的实验技术人员消除疑惑，利用这篇小文章从如下几个方面给予了简要解释。

01

致病性细菌属于不可培养微生物

2016年8月，有微生物学家在《Nature Microbiology》中发表的研究报告中指出，地球上的细菌种类可能超过1万亿种，而目前已知且可培养的细菌种类约15000种（根据2022年微生物菌种保藏联合会数据）。在对动、植物具有致病性的细菌中，至少已经证明了有部分菌株是属于“不可培养微生物unculturable microorganisms”。之所以“不可培养”主要有以下几个方面的原因。

1.1营养需求复杂。许多致病菌需要特殊的生长因子或宿主源性营养物质（如血红素、NAD等），常规培养基无法模拟体内微环境。譬如结核分枝杆菌（ Mycobacterium tuberculosis）需要在以鸡蛋成分为基础的罗氏培养基上，才能将其培养出来。

1.2环境条件苛刻。需要在特定的气体环境中培养，譬如空肠弯曲菌（ Campylobacter jejuni）就需在微需氧环境中繁殖与生长。

1.3依赖宿主温度。离体培养的细菌需要在与宿主体温相近的培养温度环境中繁殖与生长。譬如如淋病奈瑟菌（ Neisseria gonorrhoeae）就需35.0~37.0℃的恒温条件下培养。

1.4对渗透压敏感。细菌对渗透压的要求比较苛刻，需要在稳定且事宜的渗透压条件下，才能繁殖与生长。譬如霍乱弧菌（ Vibrio cholerae）就需要在碱性的蛋白胨水中，才能繁殖与生长。

1.5生长信号依赖。需要在群体感应系统（quorum sensing）调控的致病菌，需要达到临界细胞密度才能生长。譬如铜绿假单胞菌（ Pseudomonas aeruginosa）的生物膜（biofilm）形成需要自体诱导分子的出现与存在。

1.6代谢状态特殊。有些种类的细菌在进入“可存活但非可培养状态viable but non-culturable，VBNC”的细菌，活着仍具有毒力但不可培养。譬如伤寒沙门氏菌（ Salmonella typhi）在低温水中会进入VBNC状态。

1.7宿主互作缺失。一些种类的胞内寄生菌，譬如军团菌、衣原体，需要在真核细胞提供的特定细胞器中繁殖与生长，一旦与宿主免疫系统的动态互作无法在体外重现，就成为不可培养。

针对不可培养的细菌，虽然有了以下具体的解决方案，譬如使用共培养系统（如与宿主细胞共培养）、微流控芯片模拟体内微环境、宏基因组学等免培养检测技术、在培养系统中添加信号分子（如cAMP、铁载体）等。值得注意的是，随着培养组学（culturomics）的发展，原本“不可培养”的致病性细菌已有约30.0%通过改良培养方法获得了一定程度的突破，但仍有大量病原体-宿主互作机制有待解析。

02

患病养殖鱼类免疫防御系统清除了致病性细菌

养殖鱼类受到细菌感染后，其免疫系统就会立即启动一系列复杂的免疫防御机制以清除入侵到机体内的致病性细菌。以下就是遭受感染后的养殖鱼类发生该免疫应答过程的几个关键环节。

2.2应答阶段。主要包括体液免疫应答•产生抗菌肽（如防御素、溶菌酶）•补体系统激活形成膜攻击复合物•凝集素途径产生调理素作用。

细胞免疫应答→血细胞（如粒细胞、单核细胞）进行吞噬作用→呼吸爆发产生活性氧物质→释放一氧化氮等杀菌因子等过程。

2.3炎症反应。释放细胞因子（如TNF-α，IL-1β），血管通透性增加促进免疫细胞募集，发热反应抑制细菌生长。

2.4记忆形成。部分种类的养殖鱼类，存在形成特异性免疫记忆（immunological memory），以及二次应答（secondary response）更快速高效的生理功能。

因为养殖鱼类的整个免疫系统在进行免疫防御过程中，会受到神经-内分泌-免疫网络的精密调控，温度、溶氧等环境因素会显著影响免疫防御过程中的免疫应答效率。不同鱼类因进化地位的差异，其免疫系统的复杂程度也存在显著区别，对入侵到机体内的致病性细菌的免疫防御和清除效率，也会显示出显著地差异。

03

培养基与培养条件的选择不当

如果研究者选择培养细菌的培养基中，缺乏培养细菌所需要的某种或者某些营养物质的话，细菌就不可能在这种培养基中繁殖与生长。这是因为微生物生理学研究结果表明，不同种类的细菌对营养物质的需求可能是有所不同的。

在微生物学的发展过程中，众多微生物学家已经开发出来了数千种适合培养不同种类细菌的培养基。在这些培养基配方中，如果只能满足个别种属细菌的营养需求，就被称为“选择培养基selective medium”，而如果培养基中所含的营养物质能同时满足多种属细菌的营养需求，也就被称为“万能培养基universal medium”。时至今日，随着微生物学研究的不断深入发展，培养更多种属细菌的培养基的商业化开发也依然是属于热点问题。

04

水产养殖业者对患病养殖鱼类投喂了抗菌药物

如果用于分离致病性细菌的患病养殖鱼类，在采样之前就已经被水产养殖业者投喂了某种水产用抗微生物兽药，所用药物已经将入侵在去体内的致病性细菌杀灭了的话，在这样的患病养殖鱼类体内，可能也难以分离到致病性细菌了。

05

同时有其他病原（如病毒）感染，对分离致病性细菌形成干扰

如果患病养殖鱼类除感染某种致病性细菌之外，还同时又某种病毒感染的话，入侵在养殖鱼类体内的病毒，也可能会对成功获得患病养殖鱼类体内的分离菌株造成干扰，其主要原因如下。

5.1对实验室检测干扰。病毒在受感染养殖鱼类体内复制，可能抑制宿主免疫反应，改变细菌的增殖特性；其次，病毒导致的细胞病变可能掩盖细菌的分离培养特征等。

5.2样本处理收到影响。病毒裂解细胞会释放胞内酶，加速样本中细菌DNA/RNA降解，影响细菌培养特性；其次，有部分病毒（如虹彩病毒）可整合宿主基因组，可干扰细菌核酸提取纯度。

5.3细菌培养特性改变。譬如某些种类的病毒（如弹状病毒）可抑制宿主代谢，可以影响细菌对培养基的利用；其次，入侵在养殖鱼类体内的病毒可诱导宿主分泌的干扰素，可能间接抑制细菌生长。

• 文/ 华中农业大学 陈昌福、武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军