论文：黑麦草与配合饲料对鲂鲌杂交种生长、消化及鱼肉品质的影响

      黑麦草与配合饲料对鲂鲌杂交种生长、消化及鱼肉品质的影响

林 欣，郑国栋，苏晓磊，陈 杰，邹曙明

( 上海海洋大学，农业农村部团头鲂遗传育种中心，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，水产科学国家级试验教学示范中心，上海 201306 )

鱼类的远缘杂交可以将亲本的优良性状结合[1]。由于杂交子代包含了两套甚至多套不同物种的基因组，通常表现出生长速度快、肌肉品质提高等方面的杂种优势[2-3]。顾志敏等[4-6]研究表明，团头鲂(Megalobramaamblycephala)♀×与翘嘴鲌(Culteralburnus)♂的组合杂交获得的子代，均具有明显的杂种优势，并且含肉率、体蛋白质含量高。以团头鲂为母本的鲂鲌杂交种后代不仅保留了亲本的杂交特性，而且其食性更偏向于草食性亲本团头鲂[7]。目前草食性鱼类的养殖模式主要有两种：一种是青饲料投喂模式，其养殖成本低，经济效益高，鱼体形匀称[8]，但青饲料中营养成分较少；另一种是配合饲料养殖模式，配合饲料营养丰富全面，但在饲料生产及鱼类养殖等过程中，饲料中的维生素等成分会遭到不同程度的破坏，长期单一投喂配合饲料极易使鱼类因营养过剩而患脂肪肝和肠炎等疾病[9]，并且会提高养殖鱼类的发病率。这不仅增加了养殖风险，而且还造成养殖鱼的体形肥胖，不受消费者喜爱[10]。不同的养殖模式对水产品风味的影响也较大[11-12]，而鱼肉的滋味是水产品整体风味的重要组成部分，好的味道能调动消费者的消费欲望[13]。

消化道结构可以随着鱼类食物的变化而调整。许多鱼类孵化初期具有肉食性或杂食性的特征，随生长发育而逐渐形成食草特性，消化道也随之变长[14-16]；草食性鱼类由于消耗更多青饲料，其肠道会随个体生长而不成比例地增长[17]。不同食性鱼的肠道组织显微结构有较大差异。肉食性的鲇(Silurusasotus)和草食性的草鱼(Ctenopharyngodonidella)肠道肠壁杯状细胞微绒毛具有显著差异，且草鱼的折叠黏膜少于鲇[18]。肠道内消化酶活性是影响鱼类代谢吸收的重要因子，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等[19-20]，不同食性鱼类的消化酶分泌也具有显著性差异[21-23]。

黑麦草(Loliumperenne)作为青饲料在水产养殖方面的应用多集中在草鱼的饲养方面。尚未见关于黑麦草饲养鲂鲌杂交种及鲂鲌杂交种在摄食黑麦草后肌肉品质等方面的研究报道。前期以草食性的团头鲂(♀)(2n=48)和肉食性的翘嘴鲌(♂)(2n=48)为亲本，进行人工杂交育种，获得了两性可育的异源二倍体正交品系鲂鲌杂交种(F1～F3)。母本团头鲂是草食性鱼类，父本翘嘴鲌是肉食性鱼类，两者杂交产生的鲂鲌杂交种的食性及其对不同食物的反应还有待研究。因此，笔者对鲂鲌杂交种摄食不同饵料后的消化特征和滋味等进行比较研究，有利于了解鲂鲌杂种的食性特征及肉质营养特点，进而为鲂鲌杂种养殖及推广提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验鱼及分组设计

试验用鲂鲌杂交种F3由上海海洋大学团头鲂遗传与育种中心提供。挑选体色和形态正常、体格健壮、摄食良好、体质量(29.7±1.96) g的鲂鲌杂交种子代鱼种120尾，随机分成2组，每组3个平行，每个平行20尾。一组投喂黑麦草，另一组投喂高蛋白配合饲料。

1.2 试验饲料

黑麦草来自上海海洋大学团头鲂遗传与育种中心种植的鲜草(鲜样)，投喂之前将新鲜的黑麦草剪成长度1～2 cm的小段。配合饲料购自浙江某生物科技有限公司，为长度1.5 cm、横截面直径约0.3 cm的圆条状饲料(干样)，饲料蛋白源主要为优质鱼粉，蛋白含量为49.68%，而普通鲂鲌鱼类配合饲料的蛋白含量为30%，本试验所选饲料比普通饲料蛋白含量高19.68个百分点。黑麦草及配合饲料中各主要成分参考文献[24]及饲料厂家说明，其主要营养成分对比见表1。

表1 黑麦草和配合饲料主要营养成分 %Tab.1 Main nutrients of grass L. perenne and compound feed

1.3 试验条件及管理

养殖试验在上海海洋大学团头鲂遗传与育种中心进行。试验鱼养殖在同一个室内循环水池中，水池规格为4.0 m×6.0 m×1.8 m。黑麦草组与配合饲料组中每个平行的试验鱼分别放置在不同的网箱中饲养，网箱规格相同，均为1.0 m×1.0 m×1.5 m。试验开始前先用普通商品饲料驯化2周使试验鱼适应养殖环境。饲养期间水温保持在24～28 ℃，pH为6.8～7.5，溶解氧水平>6 mg/L。日投喂2次(8:30、16:30，黑麦草组投喂剪碎的黑麦草、配合饲料组投喂高蛋白配合饲料)至饱食水平(以3 h能吃完饲料判断达到饱食状态)，两组饲料的日投饵量为鱼体质量的2.0%～4.0%，根据每日试验鱼的具体摄食情况适当调整。整个试验周期为30 d。

1.4 样品采集与分析

试验结束后，试验鱼停食24 h，测量并统计每个网箱中试验鱼的摄食量和存活数。取各网箱中试验鱼放入间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉液(400 mg/L)中麻醉后测量试验鱼终末体长、体质量。随后每个平行随机取10尾试验鱼冰上进行活体解剖，称量内脏团、肝胰腺、肠道的质量，并测量肠道全长。取背侧肌肉及肠道：每尾试验鱼称取2 g背侧肌肉用于肌肉电子舌测定，另取2 g背侧肌肉用于肌肉呈味核苷酸测定，剩余肌肉用于肌肉成分的测定；取肠道用于肠道消化酶活性的测定。每个平行另取5尾试验鱼解剖取肌肉、肝胰腺和肠道组织用于组织形态学观察。有关生长及形态学指标的计算公式如下：

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

CF=100m/L3

wVSI=mv/m×100%

wHIS=mh/m×100%

wISI=mG/m×100%

I=LG/L

RS=nt/n0×100%

式中，wWGR为质量增加率(%)，RSG为特定生长率(%/d)，CF为肥满度，wVSI为脏体指数(%)，wHIS为肝体指数(%)，wRGW为肠体指数(%)，I为比肠长，RS为存活率(%)，t为饲养时间(d)，m0为初始平均体质量(g)，mt为终末平均体质量(g)，mv内脏质量(g)，mh肝脏质量(g)，mG为肠质量(g)，LG为肠长(cm)，m为体质量(g)，L为体长(cm)，n0和nt分别为各组试验初始、终末试验鱼数量(尾)。

1.5 肌肉成分检测

肌肉粗蛋白含量采用凯氏定氮仪(Kjeltec 2200，FOSS，丹麦)测定；粗脂肪测定采用甲醇—氯仿法；灰分测定采用高温炉(纳博热N7/H/P300，德国)550 ℃灼烧法；水分含量测定采用105 ℃恒温烘干法。

1.6 肌肉、肝脏和肠道的组织学分析

利用尼康Eclipse 80i显微镜及照相系统(日本)观察肌肉、肝胰腺和肠道的形态结构。肌肉、肝脏和肠道组织取出后用生理盐水清洗血迹后，浸泡于波恩氏液24 h，转移至70%乙醇中，于70%～100%乙醇中逐级脱水，经二甲苯透明，石蜡包埋，切片及苏木精—伊红染色后，于光学显微镜下观察并拍照保存。

1.7 肠道消化酶活性检测

在冰上取出肠道后，用冷冻生理盐水(0.7%)洗净肠道内容物，吸水纸吸干水分。约取50 mg样品，加入样品量1∶9(质量比)的冷冻生理盐水，在冰浴中充分匀浆，匀浆液4 ℃、3000 r/min离心(离心半径6 cm)15 min，取上清液用于测定胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性。胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。用紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)按试剂盒说明书所示方法测定，通过标准曲线计算样品中各消化酶活性。

1.8 电子舌检测

每个平行取出的新鲜背部肌肉隔水蒸制10 min后，加25 mL 超纯水，均质2 min后超声5 min，静置30 min，4 ℃、10 000 r/min离心(离心半径6 cm)15 min，取上清液。沉淀重复上述操作，合并两次上清液后过滤，定容至250 mL，每平行取80 mL滤液倒入电子舌专用进样杯中，室温25 ℃进行测定。电子舌在使用前需要校准，每个样品杯中的样品重复测定7次。

1.9 5′-核苷酸的测定

参照文献[25]的方法测定，略有修改。

HPLC参数：色谱柱ODS-3/C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，柱温30 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL；紫外检测器检测波长245 nm。

流动相A为CH4O，流动相B为20 mmol/L磷酸二氢钾与20 mmol/L磷酸氢二钾溶液，并用磷酸调节pH至5.75，梯度洗脱。

1.10 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示，并用SPSS 22.0统计分析软件分析试验数据，在单因子方差分析的基础上采用t检验法检验组间是否存在显著差异，P<0.05认为存在显著性差异。

2 结 果

2.1 不同饵料对鲂鲌杂交种生长及形态学指标的影响

配合饲料组的质量增加率和特定生长率均显著高于黑麦草组(P<0.05)(表2)；与黑麦草组相比，配合饲料组的肥满度、脏体指数和肝体指数显著上升，但肠体指数和比肠长显著下降(P<0.05)(表3)。

表2 黑麦草和配合饲料对鲂鲌杂交种生长性能指标的影响Tab.2 Effects of grass L. perenne and compound feed on the growth performance of hybrid bluntnose black bream M. amblycephala ♀ × topmouth culter C. alburnus ♂ (MC)

表3 黑麦草和配合饲料对鲂鲌杂交种形态学指标的影响Tab.3 Effects of grass L. perenne and compound feed on the morphological indices of hybrid MC

2.2 不同饵料对鲂鲌杂交种肌肉成分及形态的影响

配合饲料组水分含量显著低于黑麦草组(P<0.05)。但配合饲料组的粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的含量均显著高于黑麦草组(P<0.05)(表4)。两组试验鱼肌肉形态的石蜡切片观察结果见图1。由图1可见，配合饲料组肌纤维束面积[(7823.61±3439.73) μm2]极显著大于黑麦草组[(3580.54±1778.47) μm2](P<0.01)，并且配合饲料组肌纤维间脂肪积累也比黑麦草组多。

表4 黑麦草和配合饲料对鲂鲌杂交种肌肉成分的影响 %Tab.4 Effects of grass L.perenne and compound feed on muscle nutrients of hybrid MC

图1 两组试验鱼肌肉切片Fig.1 Muscle sections of test fish in the two groups a.黑麦草组；b.配合饲料组；MF.肌纤维；F.肌纤维间脂肪积累.a.L. perenne group;b.compound feed group;MF.muscle fiber;F.fat accumulation between muscle fibers.

2.3 不同饵料对鲂鲌杂交种肠道消化酶活性的影响

两组试验鱼肠道消化酶活性见表5。与配合饲料组相比，黑麦草组胰蛋白酶和脂肪酶活性显著降低(P<0.05)，但淀粉酶活性却显著升高(P<0.05)。

表5 黑麦草和配合饲料对鲂鲌杂交种消化酶指标的影响 U/mgTab.5 Effects of grass L. perenne and compound feed on digestive enzyme indices of hybrid MC

2.4 不同饵料对消化道组织结构的影响

摄食不同饵料后，两组鱼肝胰腺和肠道石蜡切片观察结果见图2。黑麦草组肝胰腺细胞排列略致密，肝胰腺细胞间脂肪少量分布。配合饲料组肝胰腺细胞排列松散，肝胰腺细胞间脂肪堆积相对较多。且配合饲料组肠肌层厚度[(52.46±6.41) μm]显著大于黑麦草组[(41.60±5.01) μm](P<0.05)，肠道单个褶皱绒毛层杯状细胞数量[(34.86±8.32)个]极显著高于黑麦草组[(15.67±3.87)](P<0.01)。

图2 两组试验鱼肝脏和肠道组织切片Fig.2 Histological sections of liver and intestine of test fish in the two groups a.黑麦草组肝脏切片；b.配合饲料组肝脏切片；c.黑麦草组肠道切片；d.配合饲料组肠道切片；FG.细胞间脂肪；HG.肝细胞 N.细胞核；GC.杯状细胞；MT.肌层厚度.a.liver in grass L. perenne group;b.liver in compound feed group;c.intestine in grass L. perenne group;d.intestine in compound feed group;FG.intercellular fat;HG.liver cell;N.nucleus;GC.goblet cell;MT.muscular thickness.

2.5 电子舌分析

主成分1贡献率为95.69%、主成分2贡献率为3.81%，主成分累计贡献率达到99.50%(图3)。两组样品在主成分分析图中分布呈现一定的规律，两者的二维截距大小为黑麦草组>配合饲料组。

图3 电子舌主成分分析Fig.3 Principal component analysis diagram of electronic tongue

2.6 核苷酸分析

肌肉中3种呈味核苷酸(5′-腺苷一磷酸、5′-肌苷一磷酸、次黄嘌呤)在两组试验鱼中均有检出，且差异较大(表6)。黑麦草组中5′-腺苷一磷酸、5′-肌苷一磷酸含量均高于配合饲料组(P<0.05)，且5′-腺苷一磷酸含量在两组间差异极显著(P<0.01)，而次黄嘌呤含量却显著低于配合饲料组(P<0.05)。

表6 呈味核苷酸含量 mg/100 gTab.6 Taste nucleotide content

3 讨 论

3.1 不同饲料对鲂鲌杂交种生长及肌肉营养成分的影响

蒋文枰等[26]对鲌鲂品系的肌肉营养成分的研究结果表明，鲌鲂杂交种在肌肉基本营养成分及氨基酸、脂肪酸水平方面均不同程度地高于亲本，具有优于其亲本及其他经济鱼类的营养价值优势。这说明鲂鲌杂交种可作为一种新型的水产养殖对象推广养殖。

关于投饲青饲料养殖鱼类的研究大多集中在草鱼饲养方面。朱庆红等[27-29]研究显示，颗粒饲料与青饲料结合投喂草鱼能促进草鱼生长，提高草鱼存活率，增加养殖收益；郭建林等[30]研究表明，单一投喂浮萍时，草鱼的生长缓慢。本试验结果表明，投喂黑麦草组的鲂鲌杂交种的特定生长率和体质量增加率均比配合饲料组低，与草食性鱼类相关的研究结果一致。

近年来，鱼体体形已成为评价商品鱼品质的指标之一，消费者对水产品的品质要求越来越高，良好鱼体体形不但受消费者欢迎，还具有更高的商品价值。因此，本试验测定了肥满度、脏体指数、肝体指数、肠体指数等形体指标。结果显示，投喂配合饲料组的鲂鲌杂交种肥满度较大，显著大于黑麦草组，在形体上表现为，摄食黑麦草的鲂鲌杂交种体形较为细长，表明在饲料养殖鲂鲌杂交种过程中适量投饲黑麦草可改善鲂鲌杂交鱼的肥满度。这与郭建林等[30-31]对草鱼养殖的研究结果一致。投喂黑麦草组的试验鱼脏体指数与肝体指数显著低于投喂配合饲料组，肠体指数却显著高于配合饲料组，这可能是由于黑麦草较配合饲料具有较高的粗纤维含量和较低的蛋白含量，鱼体通过自身调节，可能需要摄食更多的黑麦草才能满足每日生长所需营养。

在相同的养殖条件下，不同饲料可能导致鱼体营养成分的变化[32]，而鱼肉的营养价值主要取决于蛋白质和脂肪含量[33]。本试验中，鲂鲌杂交种在摄食高蛋白的配合饲料后鱼肉水分含量显著低于摄食黑麦草组的肌肉水分含量，而粗蛋白含量和脂肪含量显著高于黑麦草组；肌肉的石蜡切片观察显示，配合饲料组肌纤维面积极显著大于黑麦草组。以上的试验结果表明，投喂高蛋白的配合饲料可以使鲂鲌杂交种生长更快，肌肉营养相对更高。

3.2 不同饲料对鲂鲌杂交种消化道结构和消化酶活性的影响

有研究显示，部分鱼类在摄食高蛋白配合饲料后，易产生肝脏肥大、组织脂肪积累或肝细胞病变等症状[34]，如斑点叉尾(Ietaluruspunetaus)[35]、乌鳢(Channaargus)[36]。本试验结果也显示，鲂鲌杂交种在摄食配合饲料后，相比于黑麦草组其肝组织间具有更多的脂肪粒和肝细胞聚集堆积。肠杯状细胞是散布于肠黏膜上皮中的黏液分泌细胞，在机体中扮演了一个“保护者”的角色[37]。通过石蜡切片观察发现，配合饲料组的肠肌层厚度显著大于黑麦草组，肠道单个褶皱绒毛层杯状细胞个数极显著高于黑麦草组。这说明鲂鲌杂交种在摄食配合饲料后，其肠道杯状细胞增多，增加肠道内黏蛋白的分泌，使肠道内黏液增多，这可能是鲂鲌杂交种在摄食配合饲料后机体的反应。

肠道是无胃鱼食物消化吸收及运输的主要场所。鱼类消化道形态和消化酶活性与食物具有适应性[38-44]。胰蛋白酶在蛋白消化中发挥着至关重要的作用[45]。本试验结果显示，黑麦草组的胰蛋白酶活性显著低于配合饲料组，这可能是由于配合饲料所含蛋白质较高，鲂鲌杂交种需要调节胰蛋白酶活性才能将较高的蛋白质分解利用。饲料中的脂肪是维持鱼类正常生长发育及性腺发育的必需营养素。Hoehne-Reitan等[46-47]研究表明，脂肪酶的活性与饵料中脂肪含量正相关。笔者研究也发现，配合饲料组的脂肪酶活性显著高于黑麦草组，这可能主要由两种饲料原的脂肪含量差异较大所致。淀粉酶是水解淀粉和糖原等一类酶的总称，鱼类几乎所有的消化器官中均有淀粉酶。倪寿文等[48]对鲤(Cyprinuscarpio)、草鱼、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)等进行研究后认为，淀粉酶主要由散布在肝脏内的胰组织分泌，最后在肠道内激活。本试验结果显示，摄食黑麦草的鲂鲌杂交种的肠道淀粉酶活性显著高于摄食高蛋白饲料的鲂鲌杂交种，另外黑麦草组鱼体的比肠长和肠体指数均高于配合饲料组，这可能是因为鲂鲌杂交种的整个肠组织均有淀粉酶分布，而黑麦草组的肠道相对较长，显著提高了肠道总淀粉酶活性。

综上，鲂鲌杂交种在摄食不同饵料后，机体的反应也不同。肠道胰蛋白酶、脂肪酶活性与饲料中的蛋白质和脂肪的含量有关，表现出一定的适应性；淀粉酶活性则因为肠道长度的增加而整体有所升高。黑麦草组的肠体指数显著增加，说明肠道内容物较多，鱼摄食量增加，相比于高蛋白饲料组，鱼体可能需要摄食更多的黑麦草才能满足其生长发育的需要。

3.3 不同饵料对鲂鲌杂交种肌肉滋味的影响

主成分分析图中判别指数能够表示样品的区分度，判别指数在50～100表示区分有效，并且数值越大区分越明显[49]。主成分分析图主要是以二维散点图来表示，通常情况下，主成分累计贡献率超过85%就说明可以较好地反映原来多指标的信息。本次试验结果显示，判别指数为82，可以说明电子舌完全可以分开两组样品。并且主成分1贡献率为95.69%、主成分2贡献率为3.81%，主成分累计贡献率达到99.50%超过85%。这说明该图能够有效反映两种样品的滋味轮廓差异。而且两组样品在主成分分析图中分布呈现一定的规律，两者的二维截距为黑麦草组>配合饲料组。由此可以得出，不同饲料饲养条件下，鱼肉的滋味也会发生改变，且不同的饲料对鱼肉滋味的影响程度不同。

核苷酸及其降解产物在水产品中是对滋味贡献较大的呈鲜味物质之一，主要包括5′-腺苷一磷酸、5′-鸟苷酸、5′-肌苷一磷酸、5′-黄苷酸4种核苷酸。有研究表明5′-鸟苷酸在鱼类中含量较少[50]，5′-黄苷酸由5′-肌苷一磷酸在鱼体死后发生氧化反应产生。本试验在低温条件下取肉后立即处理，并未产生大量5′-黄苷酸，因此不研究5′-鸟苷酸、5′-黄苷酸的变化。Bremner等[51]研究表明，次黄嘌呤会呈现苦味，造成滋味变差，因此通过5′-腺苷一磷酸、5′-肌苷一磷酸、次黄嘌呤含量的变化来反映鲂鲌杂交鱼在摄食黑麦草与配合饲料后鱼肉滋味的差异。结果显示，在摄食不同食性饲料后，鱼肉的呈味核苷酸含量差异很大，黑麦草组中的5′-腺苷一磷酸、5′-肌苷一磷酸含量均高于配合饲料组，并且5′-腺苷一磷酸含量差异极显著，而次黄嘌呤含量却显著低于配合饲料组。由此可知，鲂鲌杂交种摄食草食性饲料后，其鱼肉中保留较多的5′-腺苷一磷酸和5′-肌苷一磷酸，同时次黄嘌呤含量显著降低。施文正等[52]研究表明，当肌苷一磷酸与腺苷一磷酸共存时，可以呈现出鲜味和甜味。因此摄食黑麦草的鱼的肉质比摄食配合饲料的鱼的肉质更有鲜味和甜味，并且苦味较低。

4 结 论

鲂鲌杂交种在摄食配合饲料后，其生长具有显著优势，鱼肉营养丰富，并且肠道内消化酶活性相对较高，但长期摄食高蛋白饲料易造成鱼体过于肥胖，不利于鱼体健康，并且会导致鱼肉的滋味变差。而摄食黑麦草后，虽然鱼肉脂肪积累相对较低、生长相对较慢，但鱼肉的滋味表现相对更好。所以在鲂鲌杂交种的养殖过程中可以合理搭配投喂黑麦草，在满足养殖效益的同时可以改善鱼肉的滋味，提升水产品的价值。根据鲂鲌杂交种摄食不同饲料营养的特点，可以满足消费者不同的需求，同时也可以为鲂鲌杂种的大规模养殖提供参考。