论文：施氏鲟♀×西伯利亚鲟♂杂交子代胚胎发育的观察

      施氏鲟Acipenser schrenckii♀×西伯利亚鲟A.baeri♂杂交子代胚胎发育的观察

付佳琪 ，聂竹兰 ，罗秀华 ，陈哲 ，张永旺

（1.塔里木大学动物科学学院,新疆 阿拉尔 843300；2.新疆伊河鲟业科技股份有限公司,新疆 巩留 835400）

施氏鲟Acipenser schrenckii♀×西伯利亚鲟A.baeri♂杂交子代胚胎发育的观察

付佳琪1,2，聂竹兰1，罗秀华1,2，陈哲2，张永旺2

（1.塔里木大学动物科学学院,新疆 阿拉尔 843300；2.新疆伊河鲟业科技股份有限公司,新疆 巩留 835400）

对施氏鲟Acipenser schrenckii♀×西伯利亚鲟A.baeri♂进行人工繁殖，观察杂交子代的胚胎发育过程。结果表明，在水温15～22℃时，杂交鲟胚胎发育历时141～151 h，所需总积温为2 608.5～2 793.5℃·h。施氏鲟成熟卵为多黄卵，卵裂呈特殊的辐射裂，受精后胚盘隆起不明显。根据对施氏鲟♀×西伯利亚鲟♂杂交子代胚胎发育外部形态及典型特征的观察，将胚胎发育分为受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、大小卵黄栓塞期、神经胚期、眼囊形成期、心脏形成博动期和孵出期9个时期。

施氏鲟；西伯利亚鲟；胚胎发育；积温

杂交育种是鱼类育种的经典方法之一，将不同类型的亲本杂交后，可获得具有双亲优良性状的杂种优势[1,2]。自1558年至今，鱼类的杂交育种已成功获得较多的实例，如通过大黄鱼Pseudosciaena crocea♀与黄姑鱼Nibea albiflora♂杂交[3]、鮸鱼Miichthys miiuy♀与大黄鱼♂杂交[4]、施氏鲟Acipenser schrensckii与达氏鲟Huso dauricus的杂交等均获得优良的鱼类杂交品种[5]。

施氏鲟和西伯利亚鲟Acipenser baerii属鲟形目 Acipenseriformes、鲟科 Acipenseridae、鲟属Acipenser[6]。施氏鲟俗称“七粒浮子”，生长快、抗病力强等，是我国最早开发利用的黑龙江流域特有鲟土著鱼类。西伯利亚鲟俗称“贝氏鲟”，主要分布于西部的鄂毕河至东部的科雷马河之间的西伯利亚各河流之中[8]，于上个世纪九十年代引进我国。近二十年的养殖实践证明，西伯利亚鲟苗种易驯养、生长速度快、性成熟早，取得了优于其他鲟的养殖效果[9]，成为我国鲟养殖的重要种类之一。近年来，无序杂交导致鲟成活率低、生长速度慢、抗逆性差，养殖性能下降，造成巨大经济损失。杂交育种是实现鲟种质改良最有效的途径之一，已经成功应用于杂交鲟bester及杂交鲟“鲟龙1号”等培育中。本研究在鲟全人工繁殖的基础上，观察了施氏鲟（♀）与西伯利亚鲟（♂）杂交子代的胚胎发育过程，旨在丰富鲟的基础生物学内容，为提高鲟的杂交育种技术和选育出高品质的鲟品种提供参考。

1 材料与方法

试验用亲鱼均为16龄，施氏鲟♀3尾（记为1号、2 号、3 号，见表 1），体质量为（18.63±2.80）kg；西伯利亚鲟♂1尾，体质量为11.60kg；亲鱼均来自中国水产科学研究院鲟鱼繁育技术工程中心。

2016年 5月31日，在水温（13.56±0.36）℃和溶氧（8.57±0.28）mg/L下，新疆巩留县伊河鲟业股份有限公司采用地欧酮和LRH-A2配比催熟亲本。催产后，按压亲鱼腹部使卵子进入腹腔，再剖开腹腔取出游离卵子，干法人工授精，受精卵经滑石粉脱黏后，入瓶式孵化器中在（17.9±5.76）℃下孵化。孵化过程中，随机取30粒卵，在双筒解剖镜下观察胚胎发育过程（囊胚期之前，包括囊胚期，每10min取样一次；原肠胚到大小卵黄栓塞期每30min取样一次；神经胚期到孵出每60min取样一次）；60%以上受精卵达到的发育期为该期的发育时间。胚胎发育各阶段与时期以解剖镜观察后绘图完成。胚胎发育各阶段的积温（℃·h）=该阶段胚胎发育时间（h）×平均水温（℃）。

2 结果与分析

2.1 施氏鲟亲鱼的体长、体质量及受精率

不同体长和体质量的施氏鲟♀与西伯利亚鲟♂杂交后代的受精率分别为85.6%、64.3%和75.8%（表 1）。

2.2 杂交鲟胚胎发育

根据杂交鲟胚胎发育顺序及形态特点，并参照其他学者的工作[10，11]，对杂交鲟胚胎发育进行分期。受精卵在平均水温17.9℃下，历时151h孵出，整个发育过程分为卵及受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、大小卵黄栓塞期、神经胚期、眼囊形成期、心脏形成博动期和孵出期等9个时期。

表1 施氏鲟♀的体长、体质量及其与西伯利亚鲟♂杂交的受精率Tab.1 The body length and body weight of female Amur sturgeon and fertilization rate of the eggs in hybrids female Amur sturgeon♀×Siberian sturgeon♂

2.2.1 受精卵

成熟卵呈椭圆形，黑色不透明，具有丰富的卵黄物质。成熟卵的原生质由动物极向植物极逐渐减少，而卵黄则由动物极向植物极逐渐增多，色素均匀分布于植物极，动物极的原生质中央有一大一小2个色素环（图版-1）。经干法人工授精后，受精卵遇水膨胀，形成围卵周隙，受精膜变硬且有弹性。受精3～5min后，卵产生黏性，受精后15min两极分化，动物极在上，植物极在下（图版-2）。受精后1h，动物极出现较低的隆起，形成不明显的胚盘；动物极边缘出现一条暗棕色带，此带随时间延长而逐渐加深。

2.2.2 卵裂期

受精后1h40min开始第1次卵裂，为经裂。由动物极出现一条暗色的线，然后逐渐形成分裂沟，使得受精卵被分割为大小近似的2个分裂球（图版-3）。受精后2h30min，开始第2次分裂，也为经裂，形成与第1次分割互为垂直的分裂沟，并逐渐加大加深，使受精卵被分割成大小近似的4个分裂球（图版-4）。受精后5h进行第3次卵裂，同样为经裂，使得受精卵分割成大小不等的8个分裂球（图版-5）。这时第1次形成的分裂沟已在植物极闭合。受精后6h20min开始第4次卵裂，此时为纬裂，将动物极分割成16个大小不等的分裂球，少数第2分裂沟已在植物极闭合。受精后7h50min开始第5次卵裂，将胚胎分割成32个大小不等的分裂球（图版-6），第2分裂沟已在植物极闭合。本阶段历时12h。

2.2.3 囊胚期

受精后12h50min胚胎进入囊胚早期，分裂球明显小于卵裂期，相邻分裂球间界线不明显，动物极的色素变浅（图版-7）。受精后13h50min胚胎进入囊胚中期，分裂球较卵裂期小，但整体仍较大，分裂球之间的间隙显而易见。与未受精的成熟卵相比，此期植物极色素较深，植物极分裂球大于动物极分裂球。受精后16h50min进入囊胚后期。此时分裂球明显小于囊胚早期和中期，动物极分裂球显著减小，分裂球界线模糊不清，解剖镜下亦无法区分。此时动物极的色素环比未受精成熟卵动物极的色素环浅而明亮。囊胚腔形成，动物极处有轻微隆起，具有下包趋势，此时进入囊胚晚期。本阶段历时9h。

2.2.4 原肠胚期

受精后21h50min胚胎进入原肠期（图版-8），动物极明显下包，在赤道附近形成一条短而浅的色素带，随着时间的推延，色素带在变宽加长的同时出现内陷，内陷处出现一个空腔。胚环随着动物极细胞的下包和内卷而逐渐明显，此时动物极约占胚胎的2/3。本阶段历时16h。

2.2.5 大、小卵黄栓塞期

受精后37h50min胚胎进入大卵黄栓塞期（图版-9）。此时动物极和植物极的色差分化明显，动物极为淡黄色而植物极为深黑色。动物极无法辨别细胞分裂，但植物极分裂球大而明显，卵黄较大如栓塞状嵌于胚环中。受精后43h50min胚胎进入小卵黄栓塞期（图版-10）,淡黄色的动物极覆盖面积越来越大，卵黄栓逐渐变小，但原肠腔仍可见于植物极。本阶段历时8h。

2.2.6 神经胚期

受精后45h50min胚胎进入神经胚期。卵黄栓逐渐变小消失，出现胚孔，胚孔四周的动物极彼此靠近并内陷成空隙。胚孔背部出现浅沟，随时间延长而膨大，膨大处外周出现神经褶，此时脑部初现雏形。受精后49h，位于胚胎背部的神经板似马蹄形，增厚增长，神经板两侧的神经褶可见内低外高两层，称为宽板神经胚期（图版-11）。内层神经褶中部出现内陷而靠拢，形成排泄系统的原基。受精后54h15min胚胎进入神经管闭合期，神经板两侧较高的外层神经褶闭合，神经管不断加长膨大，肌节呈直线形，隐约见于胚胎躯体上。本阶段历时19h。

2.2.7 眼囊形成期

受精后61h30min胚胎进入眼囊形成期（图版-12）。胚胎头部进一步分化,脑部容积较神经胚期明显增大，可见前、中、后三部分。脑的前部两侧可见2个向外突出的眼原基，而脑的中部两侧黑色素呈弧状不断积累，形成咽弧原基。受精后62h58min，胚胎头部可见心脏原基，咽弧原基增加至3对呈新月状,排泄系统原基前部增厚使胚体隆起突出于球体，尾部则与球体分离，呈棍棒状。本阶段历时11h。

2.2.8 心脏形成博动期

受精后72h58min胚胎进入心脏形成博动期（图版-13）。心脏原基在头部前下方发育成短管状，随后变形、膨大呈S形；同时，可见眼突的晶体原基；棍棒状的尾部也逐渐变窄。受精后76h58min心脏呈波纹状，微弱博动。尾部弯曲增长，约有1/3的胚胎长度突出于球体。胚胎尾部随时间而增长，除尾部外不定期地摆动，随时间延长摆动次数逐渐增加；此期可见胚胎眼晶体及胚体在卵内转动。本阶段历时19h。

2.2.9 孵出期

受精后91h胚胎进入孵出期。棒状的胚胎尾部变为扁平状，尾部末端不断扭动接近心脏。受精后92h58min扁平状的尾部达到心脏（图版-14），此时可见血细胞在卵黄囊的血管内流动。受精后117h尾部末端与头部相遇，尾动脉内依稀可见血液流动（图版-15），胚胎动扭动频率不断增大。117h30min，尾部末端位于头上部，超过头部（图版-16），胚体转动频率继续增大。141h，胚胎孵出，头部顶端的尾部剧烈摆动，出膜后尾部继续剧烈摆动促使胚体和卵黄囊全部出膜。施氏鲟♀×西伯利亚鲟♂杂交子代由破膜孵出共持续10h（图版-17）。

水温（17.9±5.76）℃时，杂交鲟从受精至孵化出膜需 141～151h，总积温为 2 608.5～2 793.5℃·h。

3 讨论

3.1 受精卵与卵裂特征

本研究中，杂交鲟的卵径为3.4～4.5mm，比一般硬骨鱼（1.0～1.5mm）大，比鲑鳟（5.0～5.5mm）小[12,13]，与匙吻鲟 Polydon spathula（3.82～4.11mm）[14]相近，比施氏鲟（3.15～3.75mm）[10]和西伯利亚鲟（2.9～3.2mm）[15]的大，比中华鲟 Acipenser sinensis（4.3～4.8mm）[16]小。与其他鲟相似，本研究中杂交鲟受精卵由动物极向植物极卵黄逐渐增多，前三次卵裂为经裂，第四次为纬裂，动物极分裂速度快于植物极，纬裂开始后动物极表层为辐射卵裂，这和其他鲟类卵裂相似[10,11,14-19]；动物极表层各分裂球的分裂速度相似，类似于硬骨鱼类中的盘状卵裂；而植物极分裂速度较慢，为不均等卵裂，类似于两栖类[20]。由此可见，本研究中杂交鲟受精卵的卵裂方式较为原始，介于两栖类与鱼类之间。

表2 几种鲟形目鱼类胚胎发育情况Tab.2 Embryonic development of several members in Acipenseriformes

3.2 胚胎发育分期

胚胎发育是指从受精卵至胚胎孵出的整个过程。该过程中，细胞增殖的同时伴随着细胞分化，根据此特点将胚胎发育分成不同的时期[21]。不同学者对鲟类的胚胎发育分期不同，中华鲟分为19个阶段[11]，西伯利亚鲟[15]和小体鲟Acipenser ruthenus[18]分为7个阶段34个时期，达氏鳇Huso dauricus分为8个阶段36个时期[19]，杂交鲟分为7个阶段27个时期[17]，达氏鲟分为34个时期[22]，施氏鲟分为9个时期[10]，匙吻鲟分为8个时期[14]，本文同意陈静等[14]对施氏鲟胚胎发育的分期方法，杂交鲟胚胎发育也分为受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、大小卵黄栓塞期、神经胚期、眼囊形成期、心脏形成博动期和孵出期等9个时期。

3.3 胚胎发育的积温

胚胎发育时间与水温有关。鲟正常孵化水温一般为14～20℃[23]，孵化温度过高或过低，均引起胚胎发育停顿、畸形等，影响孵化率和破膜时间[11,15]。小体鲟孵化水温（18±1）℃，正常孵化率高达85%[18]；西伯利亚鲟孵化水温16.3℃，正常孵化率为80%[15]。本文中杂交鲟的孵化水温为（17.9±5.76）℃，正常孵出率为55%，明显低于小体鲟和西伯利亚鲟，这是水温的昼夜温差比较大，胚胎发育畸形率较多所致。杂交鲟胚胎发育所需积温为2 608.5～2 793.5 ℃·h，略高于施氏鲟[10]、匙吻鲟[14]、达氏鲟[22]、中华鲟[16]和山区全人工繁殖的杂交鲟[17]（表2），其原因与鲟本身及孵化水温有关，本文中杂交鲟胚胎发育处于不稳定的水体中，外界因子影响了胚胎的发育速率和成活率[15,16]。

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图版Plate

Embryonic Development of Hybrid F1of Amur Sturgeon Acipenser schrenckii♀×Siberian Sturgeon A.baeri♂

FU jia-qi1,2,NIE Zhu-lan1,LUO Xiu-hua1,2,CHEN Zhe2,ZHANG Yong-wang2
（1.College of Animal Science,Tarim University,Alaer 843300,China;2.Yi River Sturgeon Fishery Ltd,Gongliu 835400,China)