论文：养殖大鳞鲃发病死亡F3个体的微卫星标记分析

      养殖大鳞鲃发病死亡F3个体的微卫星标记分析

常玉梅1，鲁翠云1，苗建发2，李崇文2，梁利群1

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.天津市天祥水产有限责任公司，天津 310500）

采用24个已报道的多态微卫星标记对天津市天祥水产有限责任公司养殖的大鳞鲃Barbus capito F2亲本及F3成活和病发死亡个体进行基因分型，结果有8个标记无多态，13个标记用以分析本研究群体的遗传多样性、亲缘关系及遗传结构。遗传参数分析显示，13个标记在87个大鳞鲃个体中分别检测到2～7个等位基因，平均等位基因数（4.27～4.53）极显著高于平均有效等位基因数（3.09～3.22）（P＜0.01）；观察杂合度（0.58～0.64）整体低于期望杂合度（0.64～0.65），多态位点比例明显下降（8/24），表明大鳞鲃F2及F3个体的纯合度增加，遗传多样性下降。聚类分析显示，F2亲本与成活子代亲缘关系更近，聚在一起；而死亡子代单独聚为1支。遗传结构分析显示，亲本与子代清晰地划分成两大类群，多数亲本与多数成活个体归为第一类群（划分概率为51.8%～97.7%），少数亲本与多数死亡个体归为第二类群（划分概率为52.9%～98.4%），这与亲缘关系分析的结果一致，表明少数亲本是F3死亡个体遗传组成的直接贡献者。本研究初步认定，由于几个亲本的近亲交配，子代基因组纯合度增加，遗传多样性下降，抗逆性下降，这可能是F3出现不明缘由病发死亡的主要原因之一。

人工养殖大鳞鲃；微卫星标记；遗传多样性；遗传结构；近交衰退

大鳞鲃Barbus capito隶属于鲤科Cyprinidae，鲃亚科Barbinae，鲃属，主要分布在咸海（Aral Sea）和里海（Caspian Sea）两大咸水湖，具有食性广、生长速度快、肉质鲜美、耐盐碱、适应性强等优良特点，是湖区主要的名贵经济鱼类之一[1,2]。我国内陆蕴藏有丰富的盐碱水域，但大部分矿化度高，水体离子复杂等，仍处于荒芜状态。虽有小部分盐碱水体可被渔业利用，但适于盐碱水养殖的种类少，特别缺乏大型经济鱼类，其渔业生产力低下。2003年黑龙江水产研究所首次从乌兹别克斯坦咸海引进大鳞鲃鱼种。经过十几年的研究，基本掌握大鳞鲃的全人工繁殖技术[3]，详细调查研究其繁殖生物学[4,5]、耐盐碱特性[6-8]、生长和养殖模式[9]、营养需求[10]和药物毒理[11]等，为大鳞鲃在国内的大规模推广养殖积累了丰富的科研数据。目前，大鳞鲃已成功在肇东、天津、保定和青岛等低洼盐碱水域进行推广养殖，经济效益可观，已得到市场认可[12]。

然而，由于建群数量较小，近交衰退的弊端在大鳞鲃养殖过程中逐渐显现。如后代体色分化，养殖群体F2和F3出现白色和红色个体，且群体生长速度下降，体色变异个体的生长速度显著低于未变异个体[13]；病害频发，特别是2016年春季天津市天祥水产有限责任公司养殖的F3个体出现不明原因的大量死亡，死亡个体主要表现为身体极度贫血，造成一定的经济损失。

分子标记辅助育种技术是解决养殖鱼类近交衰退的有效途径，其中微卫星分子标记的多态性高、共显性分离、操作简单等优势，是多数养殖鱼类分子标记辅助育种的首选标记[14]。Geng等[15]利用磁珠富集法克隆大鳞鲃的微卫星标记，并应用在大鳞鲃F1的繁殖中；随后，鲁翠云等[16]利用24个多态微卫星标记检测F1的遗传多样性，认为F1群体的遗传多样性处于中度多态水平，遗传结构相对平衡。但后续有关F2及F3的遗传多样性筛查未见相关报道。本研究针对天津市天祥水产有限责任公司2016年养殖的大鳞鲃F3病发死亡、成活个体及其繁殖亲本，采用微卫星标记进行基因分型及数据统计，以检测F2繁殖子代的遗传多样性，探讨F3个体病发死亡的遗传因素，为大鳞鲃的规模化繁育及育种提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验鱼来源

实验鱼采自天津市天祥水产有限公司，亲本（3龄）20尾，雌雄各10尾（来自黑龙江水产研究所繁殖的F2），子代为天津天祥水产有限公司自繁F3，67尾（2龄），其中不明原因病发死亡个体34尾，成活个体33尾。

1.2 基因组DNA的提取

剪取少量95%酒精保存的大鳞鲃鳍条至离心管中，加入600μL DNA提取裂解液（成分：1MTris（pH8.0）、5M NaCl、0.5M EDTA（pH8.0）、10%SDS 和200μg/mL Proteinase K）于 55℃消化 2～4h；加入等体积的酚 /氯仿混合液（1∶1）抽提 1次，12 000r/min室温离心10min，吸取上清（大约550μL）；加入2倍体积的无水乙醇沉淀，12 000r/min室温离心10min；加入500μL70%酒精洗涤，12 000r/min室温离心5min；吸净残留酒精后，室温干燥10min，加入50～100μL 0.1×TE溶解。提取后的DNA采用Nanodrop8000测定浓度，1%的琼脂糖凝胶电泳检测完整性。检测合格的DNA稀释至10ng/μL于4℃冰箱保存备用。

1.3 微卫星标记的PCR扩增及检测

参照鲁翠云等[16]报道的序列合成24对微卫星引物，对F2亲本、F3成活个体和F3死亡个体3组样品进行PCR扩增。方法均参考鲁翠云等[16]。

1.4 数据统计与分析

根据“鱼类种质资源遗传分析平台（专利号：ZL200710144749.3）”分析软件，将3组实验鱼的基因型数据转换成0、1。然后根据遗传参数计算要求转换成PopGene（Version 1.32）软件识别的数据格式。采用PopGene软件统计3个群体在所有微卫星标记的等位基因频率、等位基因数（N）、有效等位基因数（Ne）、观察杂合度（Ho）和期望杂合度（He）等遗传参数；同时对每个群体进行哈德－温伯格（Hardy-Weinberg）平衡检验（PHWE），用 Bonferroni算法进行校正。多态信息含量（PIC）由Botstein等[17]报道的公式计算。

利用PopGen32软件计算亲本及子代间的Nei’s遗传距离。使用STRUCTURE（Version 2.3.3）聚类软件推测群体的遗传结构，评估亲本和死亡子代之间的遗传结构差异。

2 结果与分析

2.1 微卫星标记的扩增效果

24对微卫星引物，经筛选有8对引物无多态，3对引物存在缺失。将13对引物扩增稳定、条带清晰、呈多态的扩增结果用于后续的遗传参数分析。

13个微卫星标记在87个大鳞鲃个体中均获得稳定、清晰的DNA条带，在个体间表现出不同程度的多态性，等位基因数在2～7个之间，共检测到57个等位基因（图1）。

2.2 亲本与子代的遗传参数分析

亲本在13个微卫星座位的Ne为1.54（B68）～5.23（B51），平均 3.22；Ho为 0.45（B1）～0.90（B51），平均 0.60；He为 0.36（B26）～0.83（B51），平均 0.65；PIC 为 0.29（B68）～0.78（B51），平均 0.52。死亡个体的 Ne为 1.35（B68）～5.11（B51），平均 3.14；Ho为0.41（B1）～0.88（B51），平均 0.58；He为 0.326（B26）～0.82（B51），平均 0.65；PIC 为 0.22（B68）～0.78（B51），平均 0.51。成活个体的 Ne为 1.44（B1）～5.24（B51），平均 3.09；Ho为 0.21（B37）～0.88（B27），平均0.64；He为 0.31（B1）～0.82（B51），平均 0.64；PIC 为0.28（B1）～0.78（B51），平均 0.50（表 1，表 2）。亲本及子代在各遗传参数间无显著差异；但各群体内Ne显著低于 N（P＜0.05），虽然 Ho与 He无显著差异，但Ho整体低于 He。

各群体Hardy-Weinberg平衡χ2检验的无偏估测（PHWE）显示，亲本在 3 个座位（B32、B35、B43）出现遗传偏离；死亡个体出现偏离座位最多，有7个座位（B1、B20、B26、B32、B37、B43、B58）；成活个体只在 2个座位（B37、B58）出现显著偏离（P＜0.05）。

表2 亲本与子代在所有微卫星座位的群体遗传参数统计Tab.2 Summary of genetic parameters of parents and offsprings across all microsatellite loci

2.3 亲本与子代的亲缘关系分析

亲本与子代的遗传距离和遗传相似度如表3所示。由表3可知，亲本与子代的遗传距离非常小（0.0234～0.0466），具有很高的遗传相似性（0.9545～0.9769），说明子代来源于亲本，是亲本的直系后代。其中，亲本与成活个体的遗传距离最小，相似性最高，说明大部分亲本与成活个体的遗传组成直接相关，而只有少数亲本对死亡个体具有直接的遗传贡献。根据各群体之间的遗传距离，利用MEGA6.06软件，采用UPGMA法对3个群体进行聚类分析，结果亲本和成活个体聚在一起，死亡个体单独聚为1支（图2）。

图1 大鳞鲃部分亲本及子代在微卫星标记B26和B35的扩增电泳图Fig.1 Electrophoresis pattern of PCR products in some parents and their offsprings of barbell at B26 and B35 loci

2.4 亲本与子代的遗传结构分析

STRUCTURE软件对亲本和子代遗传结构分析结果显示（图3），当群体k＝2时，3个群体清晰地划分成两大结构。有14个亲本与25个成活个体及6 个死亡个体（29、36、37、39、48、50）划分到第一类群（划分概率为51.8%～97.7%）；有 6个亲本（7、8、9、10、15、20） 与 28 个死亡个体及 8 个成活个体（61、62、64、65、70、71、74、76）划分到第二类群（划分概率为52.9%～98.4%）。

表1 亲本与子代在每个微卫星座位的遗传参数统计Tab.1 Summary of genetic parameters of parents and offsprings at each microsatellite locus

表3 亲本与子代的遗传距离及遗传相似性指数Tab.3 Genetic distance and similarities between parents and their offsprings

图2 亲本与子代亲缘关系的NJ聚类图Fig.2 NJ dendrogram of genetic relationship between parents and their offsprings

3 讨论

3.1 人工养殖大鳞鲃F2及F3群体的遗传多样性

多种遗传参数均可衡量群体的遗传多样性，如杂合度、多态位点比例、等位基因数等[18]。其中，等位基因数和杂合度是微卫星分子标记数据分析中常用的两种多样性指标。这两种指标表明：本研究采用13个多态性微卫星标记在87个大鳞鲃个体中分别检测到2～7个等位基因，平均等位基因数（4.27～4.53）极显著高于平均有效等位基因数（3.09～3.22）（P＜0.01），表明人工养殖大鳞鲃 F2及F3等位基因分布不均匀；虽然观察杂合度（0.58～0.64）整体低于期望杂合度（0.64～0.65），但依据Botstein等[17]关于多态信息含量的划分标准，大鳞鲃F2及F3群体处于中高度多态性水平（PIC≥0.50）。然而，遗传多样性水平的评估，还需考虑所用标记数量及群体大小。鲁翠云等[19]和李欧等[20]通过设定标记和样本容量梯度，分别探讨养殖群体和野生群体遗传多样性评估所需的最适样本量与标记量，认为标记数量在20～25，样本量在40～50之间，各遗传参数值均趋于稳定，能够客观地评价一个物种的遗传多样性水平。本研究虽然13个标记检测结果显示大鳞鲃群体的遗传多样性水平较高，但是与鲁翠云等[16]报道的多态性标记数量相比，多态位点比例明显下降（24个标记中有8个位点无多态），说明大鳞鲃F2及F3纯合度增加，遗传多样性实际呈下降趋势。

图3 每个个体分配到群体k的概率Fig.3 Probability of each individual assigned to group k

3.2 人工养殖大鳞鲃F3子代死亡的遗传因素

与人工养殖大鳞鲃F1相比，F2及F3的遗传多样性下降。HWE平衡指数分析显示，F3死亡子代有7个座位出现显著偏离，占总标记数量的53.8%，而杂合子缺失及非随机交配群体是造成偏离HWE平衡的主要原因[21]。其次，亲缘关系及遗传结构分析显示，少数亲本自交（图2）导致大多数死亡个体与亲本及成活个体的遗传相似度降低，单独聚为1支（图1）。有研究学者认为，群体的遗传多样性每丧失10%，就会对其繁育力、存活率、生长等重要性状产生很大的负面影响[22,23]。综合这两点研究结果，认为，由于几个亲本的近亲交配，子代基因组纯合度增加，遗传多样性和抗逆能力下降，这可能是F3出现不明缘由发病死亡的主要原因之一。

3.3 人工养殖大鳞鲃的一些建议

大鳞鲃是引进种，经过池塘驯化培育至性成熟的亲本有限，而实际参与繁殖F1的亲鱼数量也很有限[12]。虽然F1的遗传多样性较丰富，但由于奠基者效应，F1的遗传组成非常相近，很容易导致近交衰退。本研究数据表明：由于累代繁殖大鳞鲃F2及F3的多态性位点比例下降，基因组纯合度增加显著，遗传多样性呈下降趋势。为避免这种情况加剧，建议对现有繁殖亲本及后备亲本进行提纯复壮，如利用微卫星标记分析繁育亲本辅助遗传多样性和遗传结构，累代繁殖同样可以维持较高的杂合度，增强养殖群体的遗传可塑性[24]；建议在养殖生产中科学地进行繁殖生产，以规避更大的经济损失。

［1］蔺玉华,耿龙武,王信海,等.池塘驯养大鳞鲃某些生物学特性研究［J］.天津师范大学学报:自然科学版,2009,10（4）:72-75.

［2］CanliM,AyÖ and KalayM.Levels ofheavymetals（Cd,Pb,Cu,Cr and Ni）in tissue of Cyprinus carpio,Barbus capito and Chondrostoma regium from the Seyhan River,Turkey［J］.Turkish JournalofZoology,1998,22（2）:149-157.

［3］耿龙武,徐伟,蔺玉华,等.大鳞鲃人工繁育技术初报［J］.吉林农业大学学报,2010,32（2）:218-220.

［4］徐伟,耿龙武,李池陶,等.大鳞鲃的人工繁殖、胚胎发育和耐盐碱测定［J］.水产学报,2011,35（2）:255-260.

［5］徐敏,杨建,姜海峰,等.NaCl盐度和NaHCO3碱度对鲤、鲫和大鳞鲃的精子活力及其受精率的影响［J］.中国水产科学,2014,21（4）:720-728.

［6］党云飞,徐伟,耿龙武,等.NaCl盐度和NaHCO3碱度对大鳞鲃幼鱼生长及鳃组织特征的影响［J］.中国水产科学,2013,20（3）:577-584.

［7］耿龙武,徐伟,李池陶,等.盐碱对大鳞鲃血清渗透压、离子含量及鳃丝Na+/K+-ATP酶活力的影响［J］.中国水产科学,2011,18（2）:458-465.

［8］耿龙武,徐伟,李池陶,等.大鳞鲃耗氧率和窒息点的测定［J］.上海海洋大学学报,2012,21（3）:363-367.

［9］徐伟,耿龙武,李池陶,等.北方寒地池养大鳞鲃生长和越冬成活［J］.淡水渔业,2012,42（1）:68-71.

［10］许红,王常安,徐奇友,等.大鳞鲃幼鱼氨基酸需要量［J］.华中农业大学学报,2013,32（6）:126-131.

［11］耿龙武,徐伟,金国雄,等.4种常用水产药物对大鳞鲃的急性毒性试验［J］.江西农业大学学报,2011,33（3）:568-572.

［12］徐伟,耿龙武,苗建生,等.耐盐碱鱼类大鳞鲃的研究现状［J］.天津农学院学报,2012,19（3）:62-64.

［13］丁辰龙,蔺玉华,王宣朋,等.大鳞鲃的人工繁殖及体色变异分析［J］.天津师范大学学报:自然科学版,2016,36（5）:60-64.

［14］孙效文.鱼类分子育种学［M］.北京:海洋出版社,2010.

［15］Geng L W,Lu C Y,Tong G X,et al.Development and characterization of twenty microsatellite markers for the endangered fish Luciobarbus capito［J］.Conservation Genetics Resources,2012,4（4）:865-867.

［16］鲁翠云,耿龙武,李超,等.微卫星标记分析大鳞鲃养殖群体的遗传结构及生长性状［J］.水产学报,2013,37（8）:1121-1128.

［17］Botstein D,White R L,Skolnich M,et al.Construction ofa genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms［J］.American Journal of Human.Genetics,1980,32（3）:314-331.

［18］Richards C and Leberg P L.Temporal changes in allele frequencies and a population’s history of severe bottlenecks［J］.Conservation Biology,1996,10（3）:832-839.

［19］鲁翠云,金万昆,孙效文,等.样本容量对养殖群体内主要遗传结构分析参数的影响［J］.水产学报,2008,32（5）:674-683.

［20］李鸥,赵莹莹,郭娜,等.草鱼种群SSR分析中样本量及标记数量对遗传多度的影响［J］.动物学研究,2009,30（2）:121-130.

［21］Reed D H and Frankham R.Correlation between fitness and genetic diversity［J］.Conservation Biology,2003,17（1）:230-237.

［22］ChangY M,LiangLQ,Ma H T,et al.Microsatellite analysis of genetic diversity and population structure of Chinese mitten crab（Eriocheir sinensis）［J］.Journal of Genetics and Genomics,2008,35（3）:171-176.

［23］Allendorf F W and Ryman N.Genetic management of hatchery stock.Population genetics and fishery management［M］.Seattle：University of Washington Press,1987:141-159.

［24］常玉梅,王文文,徐万土,等.人工繁育大黄鱼（Pseudosciaena crocea）群体 F2及 F3遗传差异分析［J］.海洋与湖沼,2009,40（4）:414-422.