桂鱼人工育种研究

翘嘴鳜( Siniperca chuatsi Basilewsky) 是一种名贵经济鱼类，广泛分布于我国的几大水系中［1］。近年来，由于水环境污染严重和缺乏科学的保种、育种方法，翘嘴鳜一些优良品质发生退化。获得抗病强、生长快、易驯食等优良性状的鳜新品系是鳜育种工作的首要问题。同时，翘嘴鳜雌雄个体生长差异较大，雌性比雄性生长较快、个体大［2 －3］，养殖全雌翘嘴鳜成为提高养殖产量和经济效益的重要途径。人工雌核发育是快速建立纯系的单性生殖方式［4］，实践证明一次有丝分裂雌核发育相当于 8 ～10 代近交才能达到的效果，一次有丝分裂和一次极体雌核发育就可以快速获得纯系［5 －7］。20 世纪70 年代后，我国开始进行人工雌核发育技术研究，目前这项技术已经成功应用于鲤( Cyprinus carpio) 、虹鳟( Salmo gairdneri) 等近 30 种经济鱼类［8 －10］。而国内对翘嘴鳜的雌核发育研究尚未见报道。本研究以翘嘴鳜为研究材料，采取经紫外线照射灭活的精子刺激成熟卵子发育，加以冷休克人工诱导获得正常的雌核发育二倍体翘嘴鳜后代，为深入研究翘嘴鳜雌核发育机理积累资料。

1 材料与方法

1. 1 实验材料

翘嘴鳜购自广东省佛山市新荣鱼苗繁殖场。选择健康，体表无伤，性腺成熟的 2 龄雄鱼和雌鱼，体重为 1. 3 ～1. 7 kg。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 精卵的收集

采用绒毛膜促性腺激素( HCG) 和促黄体素释放激素类似物( LRH － A2) 混合一次注射法对翘嘴鳜亲鱼进行人工催产。雌鱼剂量为 2 000 IU/kgLRH － A2 + 15 μg / kg HCG，雄鱼剂量减半。待达到效应时间时，用干毛巾吸干体表的水，轻压雌鱼腹部获得卵子并装于洁净干燥的孵化盆中，卵子挤出后放置于冷暗处，避光待用。

1. 2. 2 精子灭活条件筛选

取新鲜翘嘴鳜精液 500 μL，按 1 ∶ 4 比例用Hank’s 液稀释，平铺于直径 9 cm 的预冷培养皿中，厚度在 2 mm 左右，用紫外交联仪分别按 0、20、40、60、80、100、120、140 mJ / cm2进行照射失活。失活后立即与3 mL 翘嘴鳜的卵干法受精。受精卵放入孵化槽中孵化。本实验以气石充氧的方式，采用 6 L 的塑料槽作为临时孵化设施。在受精后 10 ～ 12 h 计算受精率，在孵化期计算孵化率、畸形率、成活率。

1. 2. 3 卵子激活与二倍体化

用 1. 2. 2 中确定的最佳紫外线灭活精子的剂量对精子进行处理，与卵结合受精。设计 3、5、7 min冷休克起始时间，将受精卵放入 0 ～ 3 ℃ 的冰水中处理 10、20、30、40、50 min，每组设 3 个重复，用来确定最佳的冷休克处理起始时间和持续时间。

1. 3 数据分析

记录各试验组和对照组原肠胚期、出膜期苗种数和能正常摄食个体的存活数，并计算受精率、孵化率和雌核发育率。数据采用 Excel 和 SPSS 软件处理，对不同处理方法的各试验数据采用单因素方差分析( One － way ANOVA) 和 Duncan 氏多重比较。

2 结果

2. 1 精子最佳灭活条件

不同剂量的紫外线照射精子后，处理过的精子与卵细胞结合后的受精率、孵化率、仔鱼畸形率及仔鱼成活率见图 1。在实验条件下，紫外线照射剂量为 0 时，受精率和孵化率均为最高。紫外线照射剂量为 20 mJ/cm2时孵化率最低; 随着照射剂量增加，孵化率升高，到 80 mJ/cm2孵化率达到最高;随后提高紫外线照射剂量孵化率反而下降，呈明显的 Herwting 效 应。当 紫 外 辐 射 剂 量 在 40 ～100 mJ / cm2时，各处理组的受精率没有显著性的差异，但随着紫外剂量的增加，处理组的受精率具有明显的下降的趋势。其对应的孵化率也具有相同的结果。随着紫外辐射剂量的增高，各处理组孵化鱼苗单倍体畸形率增加。当辐射剂量达到 60 mJ/cm2，各处理组孵化鱼苗的畸形率均达到 98% 以上，至 80 mJ/cm2时畸形率即达到 100%，但均未能过渡到外源性营养期，成活率为 0。可见，翘嘴鳜精子对紫外线辐射处理是很敏感的，而 80 mJ/cm2是最佳的翘嘴鳜精子灭活剂量。

2. 2 染色体加倍条件优化

试验结果归纳如表 1 所示。由表中结果可知受精后冷休克处理起始时刻、冷休克处理持续时间两因素不同，对诱导翘嘴鳜雌核发育的影响是有明显差异的。在受精后 5 min 对受精卵进行冷休克处理持续 30 min 所获得的二倍体翘嘴鳜在原肠胚时期存活率和正常出苗率均最高，分别达到 23. 34% 和4. 72% 。而其他处理组最终的正常出苗率均较低。受精后不同起始处理时刻与 5 min 处理组在原肠胚时期存活率和正常出苗率均存在显著性差异; 不同处理时间组与 30 min 处理组在原肠胚时期存活率和正常出苗率均存在显著性差异( P ＜ 0. 05) 。因此，可以确定受精后5 min对受精卵低温冷休克处理30 min 是诱导翘嘴鳜雌核发育的最佳诱导条件。

2. 3 初孵仔鱼形态学

形态学方面，正常发育二倍体组初孵鱼苗全部正常，躯干笔直，能顺利度过内源营养期，到达平游阶段并开口摄食，如图 2 － A 所示; 随着紫外线辐射剂量的增加，孵化出的正常仔鱼的数量迅速减少，至 80 mJ/cm2时畸形率即达到 100%。畸形的仔鱼表现为出膜困难，尾部弯曲而短小，在显微镜下可观察到卵黄囊粗大，围心腔扩大，具有明显的单倍体综合征，如图 2 － B 所示。单倍体仔鱼均不能过渡到平游阶段。雌核发育二倍体仔鱼和正常发育二倍体仔鱼在形态学方面没有明显的差异，如图 2 － C 所示，但发育时间要晚于正常发育二倍体仔鱼。

3 讨论

3. 1 精子灭活条件分析

使用紫外线对精子进行灭活处理，紫外线主要作用在 DNA 上。紫外线照射能破坏精子的遗传功能，但不降低它进入卵子的能力［11］。因此，灭活用的紫外线剂量越大灭活越完全。但紫外线的剂量加大将会影响精子的诱导能力进而影响孵化率。所以在筛选灭活条件时，最佳的灭活条件为可以使精子遗传失活的最低紫外线剂量。如黄河鲇( Silurusasotus) 精液在稀释后经 30W 紫外线灭菌灯 ( 波长253. 7 nm) 照距 10 cm 照射 15 min 为适宜条件［12］，日本白鲫( Carassius cuvieri) 和大黄鱼( Pseudosciaenacrocea) 精子灭活最适条件分别为为 3 000 mJ / cm2、1 692 μW•cm－ 2•s－ 1［13 － 14］，本研究采用紫外交联仪作为紫外光源，可有效控制紫外照射的时间和剂量。在用紫外交联仪照射翘嘴鳜精子时，将稀释的精液在培养皿底部铺成 0. 2 mm 左右的薄层来弥补紫外线穿透能力差的缺陷。再通过比较受精率、孵化率、畸形率和鱼苗成活率四个参数，筛选出80 mJ / cm2是翘嘴鳜精子灭活的最佳剂量。此结果与花鲈( Lateolabrax japonicus)［15］、大菱鲆( Psettamaxima)［16］等的研究结果相似。

3. 2 诱导染色体加倍的条件

本研究在受精后 5 min 用冰水对受精卵进行冷休克处理30 min，即是通过抑制第二极体的释放而获得二倍体的雌核发育翘嘴鳜，因而所获得的雌核发育翘嘴鳜均是属于减数分裂雌核发育鱼。这一结果也与其他学者在其他鱼类上获得的结果不尽相同，如黄河鲇冷处理 40 min［12］，日本白鲫受精后2 min 施以冷休克处理( 0 ～ 4 ℃ ) 40 min［13］，大黄鱼受精后 2 min 在 3 ～4 ℃海水中处理 10 min［14］为最佳。这可能与不同鱼类第二极体排放时间及卵对低温的耐受时间不同有关。第二极体的排出时间也与受精水温、卵子的成熟程度、鱼类的生长环境等有很大的关系［17 －18］，一般冷水性鱼类较迟而温水性鱼类较早。在采用温度休克时通常要用亚致死温度才能有效地抑制第二极体的放出，并且处理时间太短无抑制作用，太长则会对胚体造成较大损伤，导致孵化率下降、畸型率上升而影响整体诱导效果。因此在进行雌核发育的诱导过程中，需要多次的实验来正确判断第二极体的排出时间和受精卵对低温的耐受时间，从而来确定最佳的诱导条件。本研究中，通过设计梯度平行实验，确立了采用冷休克诱导翘嘴鳜染色体加倍的适宜条件。即在 0 － 3℃ 冰水下，冷休克起始时间为人工授精后 3 ～ 7 min均有效，以 5 min 为最适; 冷休克持续 10 ～50 min均有效，以 30 min 为最佳。

3. 3 雌核发育成活率低的原因

当前，人工诱导鱼类的雌核发育率普遍偏低［12，19 －21］。本研究中翘嘴鳜的雌核发育成活率也仅为 4. 72%。人工诱导雌核发育与鱼类的有性生殖一样，卵子和精子的质量是影响诱导率和孵化率的关键因素。低温刺激会对 “受精卵”造成不同程度的物理损伤，可能导致卵质较差的卵停滞发育或畸形发育。又由于外界孵化条件的限制，致使孵化率低。此外，也有因雌核发育而使某些隐性致死基因纯合表达的情况。这些因素的综合作用使其出苗率较低。综合上述试验研究及其结果，认为翘嘴鳜雌核发育二倍体的成功获得可为以后培育全雌翘嘴鳜优良养殖新品系奠定良好的基础，但需要对本研究中的雌核发育后代的性别比例做进一步的实验来进行证明。同时，将人工获得的纯系应用于生产，在水产科学上既有理论意义又有经济价值，但这方面的研究仍存在有许多难题，有待于进一步深入探索。

（作者不详）