论文：对虾弧菌病的研究进展

        对虾弧菌病的研究进展

吕莉，朱志东，邓剑壕，冯豆，蔡延渠，朱宇嘉，朱盛山

（广东药科大学中药开发研究所，广东 广州 510006）

弧菌科Vibrionaceae细菌菌体短小，直或弯曲，是近海河口微生物区系中的革兰氏阴性菌，广泛分布于半咸水、河口、海洋的水体和沉积物中[1]。由弧菌引起的疾病，流行面积广，发病率高，给对虾养殖业造成了巨大危害[2]。弧菌病（Vibriosis）的诊断和防治一直受到国内外对虾养殖工作者的密切关注。目前，国内外已报道的弧菌主要有副溶血弧菌Vibrio prarhaemolyticus、创伤弧菌 V.vulnificus、哈维氏弧菌 V.harveyi、溶藻弧菌 V.alginolyticus、鳗弧菌 V.anguillarium和霍乱弧菌V.cholerae等[3]。本文主要综述对虾感染弧菌病的症状、不同种弧菌的鉴定和弧菌病的防治，以期为对虾弧菌病的诊断和防治提供参考。

1 诊断

1.1 弧菌病症状

患弧菌病对虾一般表现为摄食减少，活动减弱，行为异常，如在池边浅水处不规则游动、呆滞或沉底不动等；出现不同体征，如红腿、红体、黄鳃、黑鳃、烂鳃、烂眼、体表甲壳有黑斑等；临床症状如肌肉白浊、空肠空胃、肝胰腺不同程度的损伤、血液长时间不能凝固等。邓欢等[4]报道感染鳗弧菌的对虾鳃发黄，有时鳃中还出现沉积物,鳃丝变脆弱,最终鳃丝不同程度地糜烂。陈月忠等[5]报道，感染哈维氏弧菌的对虾活力减弱，不摄食，断须，红腿，黄鳃，腹部肌肉渐至全身白浊，在暗光背景下局部或全身发光。陈强等[6]报道，感染溶藻弧菌的对虾甲壳有白斑、黑斑，黑鳃，头胸甲易剥离。张彬等[7]报道，感染创伤弧菌对虾虾苗肝胰腺颜色变淡，部分萎缩，空肠空胃，有些腹节肌肉略微白浊。

1.2 回归感染试验与弧菌鉴定

1.2.1 副溶血弧菌

1.2.1.1 回归感染试验

樊景凤等[8]取红腿病虾肌肉组织在TCBS培养基上划线数次分离纯化出一株优势菌，制成浓度为1.2×109cfu/mL的菌悬液，给健康凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei腹部注射0.1mL/尾。蔺红苹等[9]取红体病虾肝胰腺组织匀浆液在TCBS培养基上分离纯化出一株优势菌，使养殖箱水中的含菌量达1.0×108cfu/mL，浸泡感染健康凡纳滨对虾后，症状与感染副溶血弧菌自然发病的症状相似。

1.2.1.2 弧菌鉴定

樊景凤等[8]通过革兰氏染色、生理生化和16S rRNA基因序列同源性分析，显示从上述红体病虾中分离的病原菌株与副溶血弧菌颜色相似；不能在0%或10%NaCl胨水中生长，接触酶试验阳性、葡萄糖磷酸盐胨水反应（V-P）阴性；基因序列长度为570bp，与副溶血弧菌的同源性最高，达99%，鉴定为副溶血弧菌。蔺红苹等[9]也显示该菌株不能在0%或10%NaCl胨水中生长，接触酶试验、动力试验均阳性，V-P阴性，鉴定为副溶血弧菌。

1.2.2 哈维氏弧菌

1.2.2.1 回归感染试验

苏杭[10]取黄鳃、红腿濒死的凡纳滨对虾的白浊色肌肉和肝胰腺划线接种于LBN培养基上培养，分离纯化得到2株优势菌，制成浓度为3.2×105cfu/mL菌悬液，对健康凡纳滨对虾腹肌肉注射50μL/尾人工感染；黄海洪[11]取鳃丝、附肢等部位出现绿色荧光的凡纳滨对虾的肝胰腺匀浆，在TCBS平板上划线培养分离数次纯化得3株优势菌，制成不同浓度的菌悬液注射感染，感染后凡纳滨对虾病症与感染哈维氏弧菌自然发病的病症相似。

1.2.2.2 弧菌鉴定

苏杭[10]通过TCBS培养基培养、革兰氏染色及电镜下形态观察、生理生化试验和16S rRNA基因序列同源性分析，显示从病虾中分离的两菌株不能在42℃或0%NaCl胨水中生长，明胶酶试验为阳性，精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶试验、V-P均为阴性；同源性相似度达99%的有100个序列，其中与哈维氏弧菌菌株序列相似的有30个序列，与哈维氏弧菌聚类为一支，鉴定为哈维氏弧菌。黄海洪[11]采用类似分析显示，上述病虾中分离的3株病原菌均呈绿色，有荧光；赖氨酸脱羧酶试验、吲哚产生试验、明胶酶试验均为阳性，精氨酸双水解酶试验、鸟氨酸脱羧酶试验、色氨酸脱羧酶试验均为阴性；与创伤弧菌的相似度最高，与哈维氏弧菌聚类为一支，鉴定为哈维氏弧菌。

1.2.3 鳗弧菌

1.2.3.1 回归感染试验

郑国兴等[12]用灭菌针筒作红腿病虾的心脏穿刺，抽取淋巴液，接种于含有2%NaCl的营养琼脂平板上培养，分离纯化获得优势菌，制成菌悬液肌肉注射感染健康对虾，感染后症状与感染鳗弧菌自然发病虾的症状相似。

1.2.3.2 弧菌鉴定

郑国兴等[12]从病虾中分离的病原菌在TCBS培养基培养不生长；生理生化培养显示该菌不能在42℃、0%和8%NaCl胨水中生长，精氨酸脱羧酶试验、V-P试验均阳性，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶试验和吲哚产生试验均阴性，对弧菌抑制剂O/129敏感，鉴定为鳗弧菌。

1.2.4 霍乱弧菌

1.2.4.1 回归感染试验

郑国兴[13]从烂眼病虾眼球中分离得8株纯化菌，制成1 012个/mL的悬液。将健康中国对虾Fenneropenaeus chinensis浸泡在每L海水加0.2mL悬液的水中感染；王立平等[14]取肠道肿胀病虾幼体匀浆在海水营养琼脂平板划线培养，分离纯化出5株菌，制成菌悬液浸泡和肌注感染健康幼虾；曹海鹏等[15]对从患白便综合征的凡纳滨对虾肝胰腺中分离纯化得一株优势菌，以菌饵的菌浓度为1.0×108CFU/g，每日按虾总体重的2%投喂感染健康虾。上述方法感染后的对虾病症均与感染霍乱弧菌自然发病对虾的病症相似。

1.2.4.2 弧菌鉴定

郑国兴[13]将从上述病虾中分离的8株病原菌进行生化鉴定，显示8株纯化菌生物学性状基本相同，能在42℃或0%NaCl胨水中生长，不能在5%和7%NaCl胨水中生长，赖氨酸脱羧酶阳性，精氨酸、鸟氨酸脱羧酶试验均阴性，对弧菌抑制剂O/129敏感，鉴定为霍乱弧菌。王立平等[14]对上述病虾中分离的5株病原菌进行鉴定，显示基本相同的生物学性状，也鉴定均为霍乱弧菌。曹海鹏等[15]将上述病虾中分离的病原菌用API20E革兰阴性菌鉴定系统进行鉴定和16S rRNA基因序列同源性分析，显示该菌鸟氨酸试验阳性，精氨酸、赖氨酸阴性；16S rRNA序列与GenBank数据库中弧菌属菌株的16S rRNA基因序列的同源性高达99%～100%，与霍乱弧菌菌株RD1的亲缘性最近，鉴定为霍乱弧菌。

1.2.5 创伤弧菌

张彬等[7]取患空肠空胃病虾苗匀浆，离心，取上清液以生理盐水稀释，在TCBS培养基上分离、纯化得一株优势菌。经TCBS培养基培养、革兰氏染色、生理生化和16S rRNA基因序列同源性分析，显示该菌株菌落呈黄色；鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶等呈阴性反应，对弧菌抑制剂O/129敏感；与创伤弧菌（JQ307112.1）的相似度最高，同源性为98.0%，鉴定为创伤弧菌。

1.2.6 溶藻弧菌

邬长祥[16]从患病凡纳滨对虾鳃及肠匀浆中分离得到纯化菌，经TCBS培养基培养、溶藻弧菌生化鉴定和16S rRNA基因序列同源性分析，菌落不能在0%NaCl胨水中生长，能在42℃和7%、10%Na-Cl胨水中生长，动力试验为阳性；与溶藻弧菌的相似性为99%，扩增出特异性目的条带，鉴定为溶藻弧菌。

2 抑菌试验研究

2.1 抗生素类

张晓君等[17]采用常规琼脂扩散（K-B）法测定了副溶血弧菌对49种常用抗生素的药物敏感性。结果表明，副溶血弧菌对环丙沙星最敏感；对林可霉素、苯唑青霉素、新生霉素、万古霉素、麦迪霉素、阿莫西林均耐药。赵典惠[18]等采用纸片琼脂扩散法测定了创伤弧菌TO-3对44种常用抗生素的药物敏感性。结果表明，创伤弧菌TO-3对左氟沙星最敏感。姬华[19]采用微量肉汤稀释法测定了169株创伤弧菌对12种抗菌药的敏感性，发现左旋氧氟沙星的抑菌效果最明显，最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）≤0.05μg/mL，阿米卡星的抑菌效果最不明显，MIC为16μg/mL。苏杭[10]用倍比稀释法测定了6种抗生素对从病虾中分离到的哈维氏弧菌的最小抑菌浓度。结果发现，盐酸恩诺沙星最低，MIC为0.25μg/mL；甲砜霉素最高，MIC为64μg/mL。赵鲁宁等[20]用ATB药敏检测系统检测了31株鳗弧菌对28种抗生素的敏感性。结果显示菌株对林可霉素、夫西地酸、甲硝唑、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、苯唑西林和青霉素的耐药率为100%，对红霉素、原始霉素、泰洛星的耐药率为94.4%，有83%以上的菌株对12种以上的抗生素具有耐药性。

2.2 中草药

赵典惠等[18]用纸片琼脂扩散法测定了创伤弧菌TO-3对17味中草药的敏感性，对五倍子和诃子最敏感；大黄最不敏感，并采用96孔板倍比稀释法测定了五倍子、诃子和大黄对创伤弧菌TO-3的MIC和最小杀菌浓度（MBC）。结果发现，五倍子的MIC和MBC分别为0.049 mg/mL、0.098mg/mL，诃子的MIC和MBC为0.195313 mg/mL；而大黄的MIC和MBC均为1.56 mg/mL。闫茂仓等[21]用倍比稀释法测定了22味中草药对创伤弧菌的MIC和MBC，黄连的抑菌和杀菌效果最好，MIC和MBC均为0.49mg/mL，其次为连翘，MIC和MBC均为1.95 mg/mL。张晓君[22]用琼脂扩散法（打孔法）测定了哈维氏弧菌对20种中草药的药物敏感性，苏木最为敏感，五倍子次之；而桑叶、金银花等的抑菌作用最不明显；二倍稀释法测定表明，五倍子的MIC和MBC均小于0.195 mg/mL；苏木的MIC和MBC均为25 mg/mL；桑叶和金银花MIC均在100 mg/mL。郑天伦等[23]测定了15种中草药对溶藻弧菌的MIC和MBC，石榴皮和地榆的抑菌和杀菌效果最好，MIC和MBC分别为1.56和6.25 g/L；地丁和威灵仙抑菌效果最不明显，MIC均为100g/L。张明等[24]采用试管连续倍比稀释法研究发现，大黄的抑菌作用最明显，MIC和MBC分别为0.25和25 mg/mL；白头翁、鱼腥草的醇提物和五倍子、石榴皮的水提物的MIC均为3.125 mg/mL；而博落回、白头翁、五倍子、石榴皮、黄芩的杀菌作用较其他植物提取物显著，MBC均为6.25mg/mL。王玉娥等[25]采用倍比稀释法测定了10种中草药对副溶血弧菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌Vibrio fluvialis和麦氏弧菌V.metschnikovii的MIC和MBC，其中五倍子效果最佳，对副溶血、溶藻、河流、麦氏弧菌的MIC和MBC均为1.56mg/mL，对哈维氏弧菌的MIC和MBC均为3.125mg/mL；其次为黄连，对溶藻、河流、麦氏弧菌的MIC和MBC分别为3.125和6.25 mg/mL，对哈维氏、副溶血弧菌的MIC和MBC分别为6.25和12.5 mg/mL。梁利国等[26]采用试管连续稀释法测定了五倍子等7种中草药对副溶血、河口、霍乱弧菌和鳗弧菌的MIC和MBC，其中苏木、五倍子、地锦草和石榴皮4种中药具有较好的抑菌和杀菌作用，对鳗弧菌、副溶血弧菌、河口弧菌及霍乱弧菌等4种病原弧菌的MIC为0.78～6.25 mg/mL，MBC为3.12～12.5 mg/mL。周泽琴等[27]采用微量肉汤稀释法测定了NZ中药复方和12种水产养殖常用的抗菌中药产品对4株弧菌（副溶血、创伤、哈维氏、溶藻弧菌）的MIC，结果NZ方与市售“虾倍健”抑菌效果最佳，对4株弧菌的MIC在0.313～1.250g/L之间，其他市售中药MIC均大于40.00g/L。

3 临床试验研究

3.1 中草药防治

王芸等[28]将由黄芪、大黄、甘草和黄芩等比例组成的复方中草药按1%的剂量添加到饲料中，连续投喂凡纳滨对虾12d，停药16d后每尾注射50μL的1×108cells/mL副溶血弧菌液，感染对虾的7d累积死亡率（6.7%）显著低于对照组（80%）。

3.2 微生物防治

蔺红苹等[29]在水中加入副溶血弧菌菌液，水体含菌量达1×108个/mL，浸泡感染凡纳滨对虾，再分别加 0 pfu/mL、1×106pfu/mL、1×105pfu/mL和 1×104pfu/mL的噬菌体，死亡率分别是58%、8%、17%和33%。周鲜娇等[30]在副溶血弧菌终浓度达2.5×107cfu/mL水中浸泡感染凡纳滨对虾1d后，一组加入副溶血弧菌噬菌体（终浓度达1.0×106pfu/mL）浸泡，另一组用每克含噬菌体1×109pfu的饲料投喂，以不加噬菌体为对照，9d的死亡率分别为6.25%、6.25%和18.75%。

3.3 免疫防治

曹剑香等[31]以每克饲料含疫苗细胞1.0×109、1.0×108、1.0×107个的溶藻弧菌疫苗饲料和不含疫苗细胞的普通饲料投喂凡纳滨对虾，30d后每组对虾肌注1.4×107cfu/mL的溶藻弧菌0.1mL/尾，进行人工感染，15d的免疫保护率分别为66.7%、46.7%、13.3%和0。李海兵[32]分别给健康中国对虾注射50μL鳗弧菌疫苗、鳗弧菌的牙鲆抗血清和生理盐水，饲养一周后再分别给每组对虾每尾注射50μL 104cfu/mL的复状鳗弧菌进行感染。结果注射鳗弧菌疫苗、抗体和对照组对虾的累计死亡率分别为25.82%、9.09%和46.5%。朱香萍等[33]分别给对虾投喂含1%鳗弧菌卵黄抗体（IgY）和普通卵黄的饲料，并在第二腹节侧面注射含活菌数约为108个/mL的鳗弧菌菌液30μL/尾，进行人工感染，7d内试验组和对照组对虾的死亡率分别为15%和60%。

4 讨论

弧菌病是鱼虾养殖中最为严重的病害之一，严重限制了行业的发展[34]。防治虾弧菌病，早期诊断至关重要。对虾弧菌病的诊断一般靠初期症状来判断和从病虾中分离纯化出优势菌的回归感染试验。证实该优势菌是病原菌后，通过TCBS培养特征、革兰氏染色形态、生理生化和分子生物技术鉴定为何种弧菌。但是，生理生化检测的指标不一，没有统一标准，衡量指标还有待讨论。分子生物技术已广泛应用于水产弧菌的检测，如PCR技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，对快速诊断弧菌具有重要意义。

防治对虾弧菌病多用抗生素、中草药、微生物和免疫方法。抗生素易残留、耐药，大部分被列为水产养殖禁药；免疫防治虽展现出潜在的效果，但疫苗制备过程复杂，免疫效果受多种因素（如抗原的种类和性质、被免疫虾的规格、投放方法以及环境因素等）的影响[35]；微生物制剂如噬菌体面临产生抗性、安全性等问题[36]；中草药安全无残留、无耐药性、天然绿色、资源丰富，对弧菌的体外抑菌效果良好，如中药复方NZ方，对4株弧菌有效，MIC在0.313～1.250g/L，能明显降低患弧菌病对虾的死亡率。

中草药抑菌试验的结果重复性较差，MIC结果相差很大，甚至达16倍[22,25]。推测可能有以下几个原因：一是试验菌种型号和菌种活力，研究者选取的病原弧菌，有的分离自病虾，有的分离自病鱼或病死泥鳅Misgurnus anguillicaudatus[23,26]，菌种型号不一样，有的研究对冰箱中保存的菌种进行菌种复苏培养以保证菌种活力[27]；二是选取的中药材本身的影响，中药材因产地、气候、采收季节不同，同一药材成分差别很大[37]，同时选取的药材部位[38]、炮制加工方法、贮藏运输方法等[39,40]均会影响同一药材成分含量，中草药药液的制备工艺如药材粉碎目数、提取溶剂种类及体积、浓缩时间等均可能影响中药材成分含量[41-43]，这些均有待探究。