乌虾酱长期发酵过程中细菌群落演替及对生物胺形成的影响

虾酱的品质与发酵周期密切相关，随发酵时间延长，虾酱形态和风味逐渐优化，经过3 a以上的长期发酵，虾酱可呈现均匀的深褐色糊状，有醇类、醛类和酯类等风味物质形成，具有独特口感和极佳风味。

西南大学食品科学学院的邓义佳、张宇昊*和渤海大学食品科学与工程学院励建荣*等以发酵1、2、3、8 a的乌虾酱（学名糠虾酱）为研究对象，使用色差仪和描述性定量分析（QDA）法感官评价不同发酵阶段的虾酱品质；采用Illumina MiSeq高通量测序分析不同发酵阶段虾酱中细菌群落结构及多样性变化规律；运用高效液相色谱（HPLC）检测虾酱长期发酵过程中6种常见生物胺含量变化；经Pearson相关性分析探究细菌群落结构对生物胺形成的影响，识别形成生物胺的特征菌群，为精准防控长期发酵虾酱中生物胺积累提供标靶菌群信息。

1、虾酱感官特征分析

如图1A所示，发酵1 a的虾酱呈褐色，表观呈不规则颗粒状；随发酵时间延长，虾酱颜色逐渐变深；发酵8 a的虾酱呈深褐色、光滑、外观无颗粒状。由图1B可知，发酵1～8 a期间亮度（L*）值逐渐降低，发酵8 a样本的L*值低至26.77；虾酱发酵1～3 a，红度（a*）值逐渐减小，但发酵8 a虾酱的a*值增加；黄度（b*）值在发酵过程中呈先上升后下降趋势，在发酵8 a达到最低。

由图2可知，发酵1～8 a的虾酱风味存在明显差异。随发酵时间延长，虾酱的虾味、腥味和氨气味均降低，在发酵8 a达到最低；鲜味在发酵2 a达到最大值，随后逐渐降低；此外，虾酱中酸味较低、咸味较高。

2、虾酱长期发酵过程中细菌多样性变化

Illumina MiSeq测序数据统计及质控分析

由图3a可知，随测定序列数增加，所有样品可观测OTU数量不断上升；当测序深度大于25 000时，各样品中观测的OTU数量逐渐趋于平缓，样本菌落覆盖率达98.9%。由图3b可知，不同发酵阶段虾酱样品中细菌群落的相对丰度随可观测OTU数量的增加逐渐趋于稳定；当样品的可观测OTU数量大于200时，所有样品的多样性曲线趋于平滑，表明虾酱样品中细菌群落分布趋近均匀，群落结构无偏向性。从不同发酵阶段虾酱中测得总tag数分别为48 515±9 423、42 799±7 651、53 984±6 894和56 504±2 789，各筛选出（41 206±6 328）、（39 875±8 432）、（50 163±8 999）条和（55 132±5 172）条优化序列；各组有效序列数均远大于测序深度阈值（25 000），4 组虾酱样品细菌群落覆盖率达98.1%～99.5%，且测得的序列分别聚类于（1 502±87）、（2 008±113）、（1 611±202）、（515±19）个OTU（图4）。

α多样性分析

由图5可知，不同发酵阶段虾酱细菌群落的ACE指数和Chao1指数变化规律一致，随发酵时间延长，虾酱中细菌多样性逐渐增加，在发酵2 a时细菌多样性最高，表明细菌群落中物种数量较多，在发酵3、8 a时菌群多样性显著降低。Shannon指数和Simpson指数综合体现物种丰富度。发酵1 a虾酱的Shannon指数和Simpson指数与其他组相比较小，表明菌群丰富度较低，发酵2 a菌群丰富度值达到最大值，随后发酵时间延长，群落丰富度逐渐降低。此外，虾酱样品中Observed_species指数和进化距离的多样性评估指数（PD_whole_tree）也与多样性显著相关，均在发酵2 a达到最大值，在发酵8 a时最低，表明长期发酵使虾酱细菌群落单一化。

β多样性分析

由图6a可知，4 个发酵阶段虾酱样品β多样性指数显示，发酵1～3 a虾酱组样品的相异指数为0.415～0.581，表明3 组样品间物种多样性较小；8 a发酵组与1～3 a发酵组的相异指数范围为0.642～0.774，说明发酵8 a虾酱的细菌群落与中短期发酵具有显著差异。由图6b可知，基于对细菌属水平聚类分析，发现1～3 a发酵组细菌种类均聚在同一分支，8 a发酵组样品单独聚为一类，此结果与β多样性指数结果一致。表明虾酱前期发酵（1～3 a）的细菌群落结构与后期发酵（8 a）的群落结构差异较大，而在1～3 a内的发酵阶段，各组群落结构差异较小。这说明在前期发酵虾酱中细菌群落结构变化较大，后期发酵时间越长，细菌群落结构趋于稳定。

Venn图和PCA

如图7a所示，4 个发酵阶段共有的细菌种类为161 个，分别占1、2、3、8 a发酵组细菌总数的41.6%、33.5%、38.6%和69.6%，其中1、2、3 a发酵组共同含有282 个OTU，表明这3 组的细菌群落相似度较高。进一步对不同发酵阶段独有OTU数量分析可知：2 a发酵组（58 个）＞3 a发酵组（43 个）＞1 a发酵组（26 个）＞8 a发酵组（24 个），说明发酵2 a虾酱独有的细菌种类最多，随着发酵时间延长，虾酱中细菌群落结构逐渐相似。采用PCA识别虾酱样品的组内和组间差异性，根据各样品在PCA得分图中的分布区域和距离，判定样品间相似度。由图7b可知，PC1和PC2对区分样本差异的贡献率分别为53.19%和26.85%，总贡献率＞80%，表明这两个因素能够较好地反映样品中生物多样性特征。

3、虾酱长期发酵过程中细菌群落的演替分析

门和属水平细菌群落结构变化

由图8a可知，在细菌群落门水平上，1 a发酵组的优势菌群分为3 类，包括：厚壁菌门（Firmicutes，82.35%）、变形菌门（Proteobacteria，11.52%）和放线菌门（Actinobacteria，3.55%），占细菌群落总平均丰度97.37%；发酵2 a时，样品中优势菌群显著增加到10 类，新增菌群为拟杆菌门（Bacteroidetes，3.08%）、酸杆菌门（Acidobacteria，1.7%）、髌骨细菌门（Patescibacteria，1.22%）、绿弯曲门（Chloroflexi，0.66%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，0.44%）、疣微菌门（Verrucomicrobia，0.4%）和装甲菌门（Armatimonadete，0.3%），而厚壁菌门、变形菌门和放线菌门分别下降至41.11%、9.92%和2.88%；发酵3 a的虾酱样品中无明显新增菌门，绝大多数菌门的相对丰度降低，仅厚壁菌门增加至59.1%；发酵8 a后，核心优势菌门为厚壁菌门和变形菌门，分别占相对丰度的46.91%和52.42%，其他菌门的相对丰度均显著降低。

由图8b可知，在细菌属水平上，共鉴定出相对丰度高于0.1%的33 个菌属，1 a发酵组中的优势菌属为：四联球菌属（Tetragenococcus，71.7%）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter，2.73%）、芽孢杆菌属（Bacillus，1.77%）、劳尔氏菌属（Ralstonia，1.96%）、假单胞菌属（3.62%）、庞蒂亚克杆菌属（Pontibacter，2.61%）、链球菌属（Streptococcus，2.58%）、肠球菌属（2.55%）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter，1.73%）、乳杆菌属（1.32%）、玫瑰变色菌属（Roseovarius，1.17%）和副球菌属（Paracoccus，0.25%）等；当虾酱发酵2 a时，四联球菌属相对丰度降低为54.5%，而肠球菌属、嗜冷杆菌属、链球菌属、假单胞菌属相对丰度明显上升，同时出现新优势菌属包括棒状杆菌属（Corynebacterium_1，1.66%）、拟杆菌属（Bacteroides，0.78%）和不动杆菌属（Acinetobacter，0.92%）；发酵3 a时，四联球菌属相对丰度为50.56%，优势菌属以假单胞菌属（4.12%）、弧菌属（1.48%）和玫瑰变色菌属（1.26%）为主；发酵8 a虾酱样品中细菌群落构成与1～3 a样品存在明显差异，其中四联球菌属相对丰度显著降低至31.36%，假单胞菌属和弧菌属的相对丰度显著增加至23.69%和8.49%。因此，不同发酵时期在属水平下虾酱的菌群多样性具有显著差异，四联球菌属和链球菌属为虾酱整个发酵过程的优势菌属。

2种水平细菌群落多样性分析

如表1所示，穆氏葡球菌（T. muriaticus）为发酵1 a虾酱中的优势菌种，相对丰度达65.81%，随发酵期延长相对丰度整体呈降低趋势，在发酵8 a相对丰度高度显著降低且仅为5.48%（P＜0.001）。而产蓝假单胞菌（P. syncyanea）和嗜盐四联球菌（T. halophilus）、瓦拉尼链球菌（S. varani）和血光杆菌（P. sanguinicancri）在8 a发酵组中相对丰度均显著升高（P＜0.05），分别为（31.47±4.11）%、（28.49±2.34）%、（0.48±0.09）%和（0.92±0.25）%。此外，大部分丰度较高的细菌在发酵2 a的虾酱中达到峰值，如粪肠球菌（E. faecalis）、嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）、暹罗盐球菌（S. siamensis）、J. dankookensis、立克次氏体（C. cheraxi）、丝状白杆菌（L. holotrichiae），随后随发酵周期延长，相对丰度降低。

4、虾酱长期发酵过程中生物胺含量变化

不同发酵阶段虾酱中生物胺含量分析

6种生物胺混标经丹磺酰氯衍生后均在进样35 min内出峰，且色谱峰峰形对称完整、无重叠，表明洗脱程序可将生物胺较好分离。对不同发酵年份的虾酱生物胺含量分析可得（表2），1 a发酵组仅有腐胺和尸胺；2 a和3 a发酵组检出的生物胺种类一致，均含有腐胺、尸胺和组胺；8 a发酵组生物胺种类多达6种，包括：腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺，说明随着发酵时间延长，虾酱中生物胺种类逐渐增加。腐胺在1 a发酵组中含量最低，为（1.65±0.67）mg/kg，随发酵时间延长，腐胺含量在2～3 a发酵中显著升高（P＜0.05），在8 a发酵组中含量高度显著提高（P＜0.001），达到最高值（57.08±8.31）mg/kg；尸胺在1 a发酵组中检出含量最高（53.13±5.83）mg/kg，在2 a和3 a发酵组中均降低，分别为（41.11±10.75）mg/kg和（43.79±8.99）mg/kg，在8 a发酵组中降低至（35.67±6.84）mg/kg；组胺在1 a发酵组中未检出，在2、3、8 a发酵组中含量逐渐增加，在8 a发酵组中达到最大值（14.41±2.28）mg/kg；酪胺、亚精胺和精胺仅在8 a发酵组中检出，含量分别为（11.94±1.21）、（0.88±1.37）、（0.98±0.11）mg/kg。表明除了尸胺外，其他5种生物胺含量都随着发酵期延长而不断积累，发酵期越长，虾酱中总生物胺含量越高。

细菌群落结构对虾酱中生物胺形成的影响

由图9可知，虾酱中组胺、酪胺、腐胺和尸胺与发酵1～8 a阶段的优势菌群密切相关，而亚精胺和精胺与细菌群落无明显关联。组胺含量变化与德沃斯菌属（Devosia）呈显著正相关（P＜0.05），与芽孢杆菌属、劳尔氏菌属、发光杆菌属（Photobacterium）、葡萄球菌属呈极显著负相关（P＜0.01）；腐胺含量变化与劳尔氏菌属呈极显著正相关（P＜0.01），与假单胞菌属、慢生盐场菌属（Roseicyclus）、亚硫酸杆菌属（Sulfitobacter）呈显著正相关（P＜0.05）。尸胺主要与不动杆菌属呈极显著正相关（P＜0.01），与乳酸菌属和假交替单胞菌属呈显著正相关（P＜0.05）。酪胺含量变化主要与鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）呈显著正相关（P＜0.05）。

结 论

结果发现：随发酵时间延长，虾酱逐渐呈深褐色、L*值下降、b*值先上升后下降、颗粒感消失、腥味和氨味下降、鲜味在发酵2 a达到最大值。虾酱中测得的细菌分属42 个门，894 个属和600 个种；厚壁菌门和变形菌门为优势菌门，四联球菌属、嗜冷杆菌属、假单胞菌属、肠球菌属、乳酸菌属和玫瑰变色菌属为优势菌属；细菌群落多样性在发酵2 a达到峰值。虾酱中生物胺种类及含量在发酵2 a后逐渐上升，发酵8 a，样品检出腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺。Pearson相关性分析显示，与组胺呈显著正相关的为德沃斯菌属（P＜0.05），与组胺呈极显著负相关的为芽孢杆菌属、劳尔氏菌属、发光杆菌属和葡萄球菌属（P＜0.01）；与腐胺呈极显著正相关的为劳尔氏菌属（P＜0.01），与腐胺呈显著正相关的为假单胞菌属、亚硫酸杆菌属和慢生盐场菌属（P＜0.05）；与尸胺呈极显著正相关的有不动杆菌属（P＜0.01）。本研究为虾酱中功能菌株筛选和生物胺精准防控提供一定理论依据。