细胞培养工艺的早期开发

抗体药物的生产主要涉及细胞培养、分离纯化和制剂灌装三个主生产单元，其中细胞培养工序过程复杂，影响因素繁多，对蛋白的表达量和质量起着关键性的作用。动物细胞培养技术跨越百年，从茹毛饮血初期的简单维持细胞存活，到现代化培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，细胞培养工艺开发的内容及诉求正发生着翻天覆地的变化。

哺乳动物细胞培养技术是生产抗体类药物最主要的技术手段，相对于微生物或者其它哺乳动物细胞，中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）因其特有的优势被广泛使用。细胞培养方式主要包括批次培养（Batch）、流加培养（Fed-batch）和灌流培养（Perfusion），其中流加培养因操作简单、易于放大、灵活、稳定、以及重复性好等优点，已成为当今抗体类药物生产的主流方式。过去近30年中，得益于高度设计化的化学成分限定培养基及补料，利用高通量小规模培养体系在工艺条件下进行的克隆筛选，以及关键细胞培养参数的优化等，使得抗体上游流加培养工艺的产量大大提升。

工艺开发的目的在于设计一个高质量的产品，以及能持续生产出符合其预期质量水平产品的生产工艺。从药品研发和生产经验中所获得的信息与知识，为建立设计空间、质量标准和生产控制提供了科学的依据（ICH Q8）。其次，在确保抗体药物安全有效的基础上尽可能提高产量以降低成本、提高经济效益。培养工艺的开发和优化主要包括两大方面，一是培养基，二是工艺参数。通常所用的培养基可以分为传代培养基、生产培养基和补料培养基。CHO细胞无血清培养基营养成分复杂，有些商业化培养基甚至多达90多种，并且不同的营养成分之间可能还存在交互作用。因此，对于部分生物药企业来说，研发前期若要自主研发一款适合大规模CHO细胞培养的培养基较费时、费力和费钱。为了提高研发效率，加快项目推进，大多数药企采用成熟的进口或国产商业化培养基组合来筛选出适合自己项目的培养基。细胞培养工艺参数的研究，通常会基于经验知识和平台知识筛选出潜在的关键工艺参数进行开发研究，比如初始接种密度、培养温度、降温温度、降温时间、补料策略、渗透压等参数在摇瓶规模或反应器规模进行单因素或DoE设计研究，以确定影响关键质量属性的工艺参数及设定范围，选择稳健高产的细胞培养生产工艺。初始接种密度越高则到达活细胞密度峰值的时间越早，产量越高，但是细胞活率的维持可能会受到影响；培养温度越高则细胞生长越快，但会影响培养后期细胞活率维持状态以及影响蛋白质量属性（例如糖型、电荷异构体等）；pH的控制一般维持在6.6-7.4之间，降低pH可降低乳酸的积累水平和降低蛋白酸性峰含量；高的搅拌转速有助于提高Kla，促进氧传质，但同时会产生较大的剪切力，对细胞活性的维持产生不利的影响；补料策略主要是针对补料的体积及补料的时间进行研究，补料培养基是浓缩的营养培养基，会影响细胞的生长代谢、蛋白表达以及翻译后修饰，补料量过多或不足对细胞的代谢或蛋白的合成都会产生不利的影响。

DoE是工艺开发及优化过程中必不可少的基础工具之一，DoE是一种设计实验并分析所获得信息的技术。这种技术可以使我们在最小数量的实验中建立实验参数与结果的数学模型，找到最佳工艺条件，确定工艺的操作窗口。

针对不同的项目，应选择合适的工艺参数和DoE进行研究，DoE主要流程包括以下几个步骤：

1.明确实验目的或工艺开发、优化的目标；

2.根据产品概况和平台经验，基于科学的风险评估，根据实验目的筛选出潜在影响的关键工艺参数（qCPP）和研究的关键质量属性（CQA）；

3.根据待研究参数的数量和平台经验，选择合适的实验设计方法；

4.执行试验

5.获得数据并初步核对数据的科学性和可信度；

6.选择专业的分析方法进行数据分析；

7.最终得出科学的结论

结合实际的项目经验，与大家分享一个应用DoE方法来提高蛋白表达量和降低聚体比例的案例：

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实验目的

提高蛋白表达量（＞5g/L），降低聚体比例(＜4%)，电荷异构体比例符合预期设定值；

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实验设计

根据该项目前期的数据积累以及平台经验，选择渗透压、降温时间和补料策略作为研究因子，Titer、SEC和CEX作为响应变量，采用Full Factorial Design设计方法，具体实验设计方案如下：

表1. 实验设计（DoE）

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执行实验并得到数据

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应用ANOVA进行数据分析

图1. 因子与响应变量之间的相关系数图

图2. 蛋白表达量的等高线图

图3. 蛋白聚体比例的等高线图

图4. 电荷异构体酸性峰比例的等高线图

图5. 电荷异构体主峰比例的等高线图

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确定工艺操作窗口

即Sweet spot。

图6. 工艺参数的Sweet spot图

很多行业小伙伴都很关心，工艺开发和优化应该做到什么程度，做几轮可以满足IND申报及相关法规要求，回答这些问题前，我们首先需要了解产品的三大要素，即安全、有效、质量可控，任何药物的研发必须建立在安全性的基础上来考虑有效性，质量可控是药物安全性和有效性的保障。其次，应综合考虑产品的特点、推进速度、经济和成本等方面。对于一些特殊产品而言，假如采用平台工艺不能生产出符合要求的临床样品，这时候需要对特定的问题（比如聚体偏高、糖基化修饰以及原液颜色等）开展合适的工艺优化实验以提供针对性的解决方案。对于常规抗体项目而言，细胞培养工艺研究的技术路线一般包括三轮研究，第一轮培养基筛选、第二轮工艺参数研究、第三轮工艺放大确认。

目前，尚健生物上游工艺开发部已搭建了成熟的流加批次培养工艺开发平台（图7），完成了多个不同项目（包括融合蛋白、单抗、双抗）的工艺开发、技术转移，蛋白表达量均在4-8 g/L之间，成功完成了若干项目的200 L或2000 L规模的放大生产，工艺稳健。

图7. 三大工艺开发平台

参考文献：

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