大豆固态发酵过程中微生物消化酶分布变化研究

发酵本质是微生物进行新陈代谢，即利用发酵培养基中的一些多糖、蛋白质和脂肪等进行生命活动。同时，饲料发酵可以形成独特的香味、有机酸、可溶性肽、单糖和其它小分子物质，容易被动物消化吸收。

近年来，将发酵豆粕作为水产养殖中的蛋白质成分的研究逐渐增多。发酵饵料对鱼类有多种有益作用。在“凯里米酸汤”发酵过程中起主要作用的是乳杆菌、明串珠菌、醋酸杆菌和酵母菌等，但不同时间点表现出主要微生物菌群数量不一致的现象。

在酱腌菜加工的过程产生的含盐卤汁再利用的过程中，为保留营养成分需要采用一些手段杀灭或降低卤汁中的微生物。

由此，探究微生物与营养成分之间以及微生物之间的相互作用是研究发酵过程中信息流产生与交换的重要手段。

因此，本研究以芽孢杆菌、乳酸菌、酵母和曲霉四种工业常用发酵菌株，以麦麸为辅料发酵大豆，探究在6个不同的发酵时间（0d、3d、4d、5d、6d和7d）大豆固态发酵过程中的微生物群落衍替行为以及微生物与营养成分的交互作用，为微生物对发酵营养品质变化的影响提供参考。

微生物群落分析

使用PowerFecal™DNA分离试剂盒(MoBioLaboratories,Inc)从豆粕中提取16SrDNA。用515F(GTGCCAGCMGCCGCGG)和907R(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)引物扩增16SrRNA的V3-V4区域后，使用IlluminaMiSeq平台进行高通量测序。

使用BIPES流水线将原始序列根据条形码分类到不同的样本，然后使用UCHIME过滤嵌合序列。用FASTX-Toolkit去除低质量的分数后，用QIIME2将所有的序列分为相似度为100%的操作分类单元(OTU)。

使用uclust为每个OTU分配分类层次。使用muscle5（-super模式）对获得的代表性序列进行多重比对，然后使用trimAl进行修剪。根据上述获得的fasta文件构建系统发育树。

随后使用R软件包micro2eco对原始丰度数据进行子采样，以过滤掉低丰度的OTU，并过滤掉出现在少于4个样本内的OTU，并将其合并，供后续使用。

结果

聚类簇C、D虽然具有类似的时间梯度分布特征，但并没有单调性或者是明显的差异。

聚类簇C主要包括柔膜菌纲和γ-变形菌纲两个纲属细菌；聚类簇D主要包括柔膜菌纲、拟杆菌纲、放线菌门放线菌纲(Actinobacteria)和γ-变形菌纲四个纲属细菌。

聚类簇A、E告诉我们所包含的微生物仅与是否发酵相关，与发酵时间没有明显差异，即0d与3d之间具有的差异超过3~7d之间的差异表明这些微生物不受发酵环境的改变而变化，具有较强的适应能力；与之相反，聚类簇B所属细菌显示随时间的进行丰度有所上升，，发酵随着时间的进行pH会降低，基于这一原理可以认为这些细菌对生长条件比较苛刻。

聚类簇F与其它聚类簇不同，其在3d左右存有一个峰，这可能是系统差异造成，需要进一步研究确认。

α多样性是用来分析单一样品的复杂程度，即单一样品中的群落多样性程度。

其中Shannon指数描述样品中微生物的多样性，Chao1指数描述菌群的丰度，这两个参数值越大，说明样品复杂程度越高。

覆盖率是反映测序深度的指数之一，数值越高说明样本中序列被测出的概率越高。发酵过程中的OTU指数从50.14上升到60.57，然后下降到41.57，但各处理间没有显著性差异。

对样品的Shannon指数随发酵时间的变化进行显著性检验结果显示差异不显著(P>0.05)，Shannon指数趋于稳定，表明随着发酵进行大豆麸皮固态发酵过程的细菌群落多样性趋于稳定。

Coverage指数都在99.99%以上表明测序数据能够覆盖目前状态下样品中的微生物种类，能真实反映样本中的细菌群落情况，可用于后续分析。总的来说，微生物的多样性和丰富性增在时域上表现为先增加后降低的趋势，即群落结构发生了整合，但群落丰富度变化不大，趋于稳定。

根据Kruskal-Wallis检验(P>0.05)，所有组间观察到的bOTUs和Chao1指数没有明显差异，Shannon和Simpson指数的结果相反(P<0.05)。与M0组相比，Shannon和Simpson指数在3天的发酵后显示出明显的增加，并随着时间的推移而减少。

基于Bray-Curtis和Jaccard距离，计算了微生物丰度和微生物群落结构的转置距离矩阵。

主坐标分析(PCoA)显示，二维平面可以充分解释发酵时间导致的微生物丰度和群落结构的变化（布雷-柯蒂斯：PCoA1=96.3%，PCoA2=3.05%；贾卡德：PCoA1=80.6%，PCoA2=10.48%）。

为了从微生物学角度揭示上述变异的可能原因，将线性判别分析效应大小（LEfSe，LDA得分=4.0）和微阵列数据的线性模型(limma)的联合分析投入使用，用于测试微生物数据。

微生物群的LEfSe分析显示，差异性OTU是相应分类水平上得分较高的少数生物标志物，其中差异性OTU主要分布在优势门类的群体中，如蓝藻类、厚壁菌、变形菌和放线菌类。

结合分布氏族图的研究结果，在M0中排名靠前的差异化指示种不约而同地被归入蓝藻类。发酵使实验组中的芽孢杆菌以及M3和M5组中的梭状菌明显增加。

微生物共现网络

为了确定水体微生物群落中潜在的相互作用的组合，提出了六个代表性网络。直接来看，所有的网络都倾向于共存而不是共亡，正相关占潜在的相互作用的90%以上，而且随着发酵时间的增加，负边的比例也在增加。

值得注意的是，在M3组中可以发现微生物网络的互动性增强，这表现在负边的比例明显下降(1.89%)，这些负边是由厚壁菌门和其它门类之间的互动构成的。此外，M3组显示出最大的网络规模（节点数）、平均节点度(avgK)和平均聚类系数(avgCC)，同时模块数和模块化程度(M)最低。

随着发酵时间的增加，节点数、平均节点度和平均聚类系数在3天发酵后出现下降。

此外，4天的发酵贡献了一个连接器(OTU223)，根据Zi-Pi图被归入厚壁菌门，被认为是分子生态网络的关键物种。

而芽孢杆菌纲与蓝藻纲呈现抑制作用(P=0.000)，这表明在发酵过程中存在极强的竞争作用。相关系数绝对值大于0.7表明密切相关，0.4-0.7说明关系密切，0.2-0.4表明关系一般(Rumsey,2021)。

具体分析可知：酸杆菌纲与装甲菌纲，拟杆菌纲-VC2.1，黄杆菌纲，麻黄杆菌共4项之间全部均呈现出显著正相关关系。在检查所有网络的各个模块时，发现M3组不仅有少量的模块，而且节点主要集中在前两个模块中。

相反，其它组的网络模块数量多，节点分布均匀。发酵促进了所有分类水平的相互作用，这种相互作用的强度和数量随着发酵时间的增加而减少，当发酵达到4天时，在科水平开始发生变化。

微生物来源追踪分析

基于以上分析步骤，我们可以发现M3组微生物群落表现出多样性差异和功能冗余。为了研究多样性差异的来源，采用了动态贝叶斯推理神经信息流网络进行回顾性分析。将发酵时间为0d、3d、4d、5d和6d的微生物作为来源，将发酵时间为3d、4d、5d、6d和7d的微生物分别作为汇微生物。

对整体数据进行分析，发现各发酵时间作为来源的比重随着发酵时间的增加而降低，其比例分别为33.4%(M0)、23.99%(M3)、21.69%(M4)、11.49%(M5)、5.28%(M6)和4.15%（来源不明），主要表现为前一个时间点是下一个时间点的主要来源，来源不明的微生物群主要贡献于M3组。

功能预测

LEfSe分析（LDA得分=1）显示，所有的功能预测生物标志物都在M0组富集。当涉及到KEGG2级的代谢途径时，我们可以发现氨基酸代谢、能量代谢、萜类和聚酮类的代谢、外来生物的生物降解和代谢、辅助因子和维生素的代谢以及其它氨基酸的代谢。

随后，用t检验作为两组代谢相关途径的比较。可以发现，与M0组相比，所有实验组的功能预测途径都有类似的模式。

值得注意的是，在发酵过程中，与限制性氨基酸和碳水化合物代谢相关的途径被激活(P<0.05)，如果糖和甘露糖代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及赖氨酸生物合成，其相关功能基因被激活。伴随着发酵时间的增加，与赖氨酸降解和脂多糖生物合成相关的途径被下调(P<0.05)。

发酵大豆营养评估

随着发酵时间的增加，粗蛋白、酸溶性多肽、灰分、葡萄糖、总磷和能量都明显高于M0组，而脲酶和有效酸度则出现明显下降。其它参数，如果糖和总钙含量，没有明显差异。

为了确定影响微生物丰度和群落结构的主要因素，我们用冗余分析法量化了几个环境和营养因素对大豆微生物群落组成的相对重要性。

方差分解显示，总磷的独特影响解释了大豆微生物群落的最大变化，其次是果糖。酸性可溶性蛋白、灰分、果糖、总磷和葡萄糖的共同效应最高。Mantel检验显示，上述几个因素的协同作用与厚壁菌门的变化高度相关。

微生物组成分析表明，微生物群落的多样性在固态发酵过程中发生了动态变化。在发酵的早期阶段，微生物多样性的Shannon和Simpson指数先上升后下降，表明新产生的物种之间没有统计学差异。

相反，在不同的发酵时间，物种之间的同质性明显表现出差异，表明一些物种的丰度可能发生了重大变化。结合β多样性，我们可以清楚地识别出发酵组和未发酵组在物种组成和物种丰度上的显著差异。

这些细菌对评估发酵饲料很重要，可以作为指标物种来了解发酵阶段。为了了解这种差异的潜在原因，我们考虑了以下两个方面：（1）微生物群之间的相互作用；（2）微生物群与环境（或营养）的相互作用。

最近，基于植物的发酵食品因其潜在的益处而受到关注。有研究报告称，发酵可以减少抗营养因子，使原来的底物更适口、更有营养，但不排除菌种和发酵时间的作用。

适当的微生物发酵时间可以提高大豆的营养价值，可以促进动物对蛋白质和糖的消化吸收，提高饲料利用率。首先，微生物发酵降低了大豆中主要的抗营养因子—脲酶活性，并且随着发酵时间的延长，脲酶活性明显降低。

这种抗营养因子的减少表明，在动物饲料中添加发酵大豆有利于饲料的消化和吸收，促进食品高值化。在本研究中，与大豆中限制性氨基酸和碳水化合物代谢相关的途径被激活，如半胱氨酸和蛋氨酸的代谢，以及赖氨酸的生物合成，这些途径成为大豆质量改善的标志。

其次，粗蛋白含量和酸溶性多肽含量的增加表明，更适合机体吸收和利用的肽和游离氨基酸等含氮物质也得到了增加。

这可能是由于在细菌发酵大豆的过程中，微生物自身的新陈代谢使有机物完全氧化为CO2和H2O，并产生菌体蛋白。干燥的发酵大豆中碳、氢和氧的损失导致其含有的氮的相对集中，从而提高了发酵大豆的粗蛋白含量。发酵后，大豆的总能量增加。

不考虑蛋白质，我们发现另一种能量来源的含量有明显变化，发酵大豆中葡萄糖的含量随着发酵时间的延长而明显增加。这可能是由于发酵过程中孕育了一些可降解多糖的细菌，并将其分解为可用的单糖，大大提高了动物对糖的利用效率(Montoya-Camachoetal.,2019)。

事实证明，我们利用LEfSe进行差异分析发现，在发酵前期的指示菌种中存在梭菌，梭菌的主要功能是利用原料中的纤维素，促进难以利用的纤维素降解为单糖。在一定程度上，梭菌的变化可以反映出发酵的效果。

此外，伴随着较低的有效酸度，发酵本身给大豆带来了特殊的风味，可以改善适口性，提高动物采食量，从而促进动物生产。而且，由于乳酸的大量产生，较低的有效酸度可以抑制有害细菌的生长。

此外，本研究中使用的发酵菌株乳酸菌作为常见的益生菌，可以产生乳酸，改善动物的肠道微生态环境，并在其发酵饲料被动物摄入后抑制有害菌的生长，在发酵过程本身就起到了指示菌的作用。

而微生物发酵后，大豆中的灰分含量也有所增加，这仍能满足微生物生长的需要，而4天后，营养条件发生变化，有效酸度也发生变化，不再适合大多数微生物的生长。由于缺乏必要的途径或关键基因，增加的物种无法合成许多重要的营养物质。

因此，这些增加的辅食者的生存在很大程度上取决于群落，以确保碳流和副产品的交换。处于合作关系中的物种容易产生环境依赖性，因为物种的耦合和合作关系引起的正反馈循环。当物种减少时，可能会出现其它物种的迅速减少，降低群落的稳定性。因此，抑制正反馈环路和弱化相互作用可以提高网络的稳定性。

小结

在使用枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、米曲霉、酿酒酵母对大豆进行发酵，在微生物的接种量为10%的条件下固态发酵大豆的过程中，总磷含量对微生物群落衍替行为贡献最大，其次是果糖。

在使用枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、米曲霉、酿酒酵母对大豆进行发酵，在微生物的接种量为10%的条件下固态发酵大豆的过程中，厚壁菌门对酸溶性多肽、灰分、果糖、总磷和葡萄糖等营养成分具有相关效应。

来源：文山史纪

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