肥料对鱼塘菌群数量结构的影响：有机肥营养成分更丰富，肥效维持时间更长，细菌种群丰富度增加更明显和持久

水产养殖实践中，主要以施肥为滤食性鱼类和鱼苗培养浮游生物饵料［1 －2］。施肥养鱼就是向水中投施有机肥( 粪、草等) 或化肥( 包括氮肥和磷肥)来补充和增加水中氮、磷等营养元素含量，以促进浮游生物的生长繁殖。池塘、水库施肥会引起水体中氮磷含量、有机质和浮游生物量相应增加以及改变原有的水化学平衡，进而也可能影响水体微生物种群的改变。池塘、水库中数量众多、种类复杂的细菌种群可将水体中的有机质分解转化，以无机盐的形式释放到水体。同时，细菌作为原生动物直接或间接的饵料，是微型食物网中的重要一环，在水体生态系统中起着非常重要的作用［3 －5］。本研究采用 PCR － DGGE 技术对水体中分别施入有机肥和化肥后的细菌种群变化进行研究，探讨水体中细菌种群发生的变化规律。

1 材料与方法

1. 1 试验设计

试验于 2010 年 7 月在西南大学科研渔场进行，试验选择 3 个池塘，每个池塘面积为 8 m × 17 m，水深 1. 2 m，每个池塘放入 100 g 左右的鱼苗 15尾。施化肥池塘( N) 施入碳酸氢铵 0. 80 kg 和磷酸一铵 0. 25 kg，施有机肥池塘 ( M) 施入干鸡粪15. 0 kg，不施肥池塘 ( C) 作对照。碳酸氢铵和磷酸一铵分别用水溶化后均匀泼洒入池塘，干鸡粪用水浸泡 2 h 后均匀撒入池塘中。

1. 2 样品采集与处理

1. 2. 1 采样设计与测试指标

每个池塘于施肥前( 0 d) ，施肥后第 2、4、6天采样，采样时间均为每天下午 4∶ 00，每个池塘采集 4 个点，每个点用采水器采集 2 L 水样。每次采样前池塘中水温和溶氧用 SG6 溶氧仪测定，透明度( SD) 用萨氏盘测定，pH 值用酸度计测定; 氨氮( NH4+－ N) 、硝酸盐氮( NO3－－ N) 、亚硝酸盐氮( NO2－－ N) 和有效磷( PO43 －－ P) 测定按 《水和废水监测分析方法》［6］，细菌总数采用 DAPI 染色，荧光显微镜检测方法进行测定［7］。

1. 2. 2 细菌 DNA 提取

水样用直径 150 mm，孔径 0. 22 μm 的微孔滤膜过滤，滤膜上的细菌用 10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液( 10 mmol/L 磷酸盐，2. 7 mmol/L 氯化钾和 137mmol / L 氯化钠) 洗下，12000 r / min 离心 20 min，用 Soil Out DNA kit 试剂盒提取细菌总 DNA［8］。

1. 2. 3 PCR 扩增

提取的总 DNA 用引物: 357F － GCclamp( 5' －CGCCGGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG GGCCTACGGGAGGCAGCAG － 3') 和 518R( 5'－ ATTACCGCGGCTGCTGG － 3') 扩增 16S rDNA 的V3 区。 PCR 的总反应体系为 25 μL: 10 × PCRbuffer ( 含 Mg2 +) 2. 5 μL，2. 5 mmol/L dNTPs 2. 0μL，引物( 20 μmol/L) 0. 5 μL，DNA 模板 1 μL，40 mg / mL 牛血清白蛋白 5 μL，5 U / μL 的 ExTaqDNA 聚合酶 0. 25 μL，去离子水加至 25 μL。采用梯度 PCR 扩增，PCR 反应条件: 95 ℃ 预变性5 min，前 12 个循环为 95 ℃ 变性 30 s，退火温度59 ～ 54 ℃ ， 每个循环降低 0. 5 ℃ ， 复性 35 s，72 ℃ 延伸 45 s; 后 19 个循环在恒定退火温度下进行，95 ℃ 变性 30 s，54 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸45 s，最后在 72 ℃ 持续延伸 7 min，4 ℃ 保持。PCR 产物经 1. 0% 琼脂糖凝胶电泳检测［9］。

1. 2. 4 DGGE 凝胶电泳

DGGE 分析变性剂范围为 30% ～ 60% ( 100%变性剂为 7 mol/L 的尿素和 40%的去离子甲酰胺的混合物) ，10%的聚丙烯酰胺胶( 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 37. 5∶ 1) 。于 60 ℃，220 V 条件电泳 5 min，85 V 条件电泳 16 h，采用银染法显色［10］。用无菌手术刀片将 DGGE 胶上的每个 DNA 条带分别切下，用 1 × PCR 缓冲溶液 40 μL 洗涤两次，再用枪头捣碎，用 1 × PCR 缓冲溶液 40 μL 浸泡，4 ℃ 过夜;取过夜浸泡液 5 μL 中含的 DNA 片段作模板用未加夹子的 16S rDNA 的 V3 区引物进行 PCR 扩增，PCR 扩增产物用 DNA 胶回收试剂盒纯化［10］。

1. 2. 5 DGGE 条带克隆、测序

取 1. 2. 4 的 PCR 扩增产物纯化液 5 μL 加入10 μL的 PMD － 18T 载体体系中，16 ℃ 下进行过夜连接; 取 5 μL 的连接产物转入大肠杆菌 GM109 感受态细胞中，涂 LB 平板，进行蓝白斑筛选，挑取白斑，振荡培养12 h。提取培养阳性菌的质粒，用16S rDNA 的 V3 区引物按照 1. 2. 3 进行 PCR 扩增，取 5 μL 扩增产物作 DGGE 分析，将与 DGGE 分析胶上各个条带处于同一位置的不同质粒送上海英骏公司测序［11］。

1. 3 系统进化分析

将测序获得的 DGGE 条带序列与 NCBI 网络数据库 ( http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/) 中的同源序列进行比对，根据比对结果，用 Clustal1. 83和 Mega4. 0 进行相似性分析及系统发育树分析［8］。

1. 4 数据分析

用 Quantity One 4. 4. 0 软件检测 DGGE 电泳条带光密度，根据条带光密度值计算细菌种群的相对丰度［12］。根据每个样品在 DGGE 图谱上的条带信息，计算细菌 Shannon － Weaver 多样性指数( H) 、丰富度( S) 和均匀度( EH) : H = － Σpilnpi，EH=H / lnS，式中，Pi为第 i 条带光密度值占该样品总条带光密度值的比值，S 为某一泳道总条带数; 用SPSS13. 0 软件进行细菌种群相似性聚类分析［13］。

2 结果与分析

2. 1 施肥对水体理化指标和细菌数量的影响

不同时间水体的理化环境参数和细菌数量见表1。3 个池塘施肥前的温度、pH、溶氧、NH+4－ N、NO－3－ N、NO－2－ N 、PO3 －4－ P、透明度和细菌数量等相似，在试验期，3 个池塘水温在 31 ～ 33 ℃之间，变化不大，且对照池塘的这些环境理化参数在施肥前、2、4 和 6 天变化均较小，施肥池塘的环境理化参数变化较大。与对照组比较，pH 值在施化肥后升高，第 2 天达最高，之后逐渐下降，施有机肥后 pH 值则低于对照; 施化肥后池塘溶氧急剧增加，在第 4 天达到最高，而施有机肥后池塘溶氧反而下降。施化肥或有机肥后NH+4－ N和 PO3 －4－ P 浓度均增加，之后逐渐下降但仍高于对照，其中施化肥的池塘其浓度增加非常明显，在第 2 天达到最高。池塘施无机或有机肥后NO－3－ N和 NO－2－N 浓度均增加，施有机肥的池塘增加更明显，之后均逐渐下降。池塘施肥后水体透明度较对照组均下降，而施化肥的池塘水体透明度最低。

2. 2 施肥对细菌种群及多样性指数的影响

施肥与对照池塘不同时间细菌种群 PCR －DGGE 图谱如图 1 ( A) ，对各细菌种群的聚类分析如图1( B) ，细菌种群多样性指数见表2。在 DGGE图谱中，对照、化肥和有机肥池塘在未施肥时DGGE 条带数分别为 16、16 和 14 ( 表 2) ，对照和施化肥池塘的 DGGE 条带数及迁移率完全相同，而施有机肥池塘则显示一定差异，聚类分析也说明3 个池塘的细菌种群相似性非常高，而且细菌种群多样指数、均匀度和丰富度也相近。施肥后第 2 天3 个池塘 DGGE 条带数分别为 16、20 和 20，施肥池塘的细菌种群丰富度明显增加，特别是施有机肥的池塘增加更明显，与对照池塘显示出明显的差异，细菌多样性指数明显高于对照; 聚类分析显示3 个池塘之间的细菌种群相似性低于施肥前 3 个池塘的相似性。施肥后第 4 天3 个池塘 DGGE 条带数分别为 15、20 和 18，不同处理池塘细菌种群发生明显变化，聚类分析也显示不同池塘之间的细菌种群相似性极低，施化肥池塘群落结构单独聚为一族，细菌多样性指数高于对照，但以施有机肥细菌多样性指数最高。3 个池塘在施肥后第 6 天 DGGE条带数分别为 15、15 和 20，聚类分析显示施有机肥的池塘细菌种群与其第 4 天的种群结构具有较高的相似度，说明其细菌种群逐渐趋于稳定，而施有机肥的池塘水体细菌种群与其它池塘比较仍具有大的差异性和种群丰富度; 施化肥池塘的细菌种群与其它池塘的群落结构相似性增加，而细菌多样性指数下降，说明其细菌种群在逐渐恢复为施肥前的种群结构。而对照池塘的细菌种群在第 2、4 和 6 天时与施肥前具有较高的相似性，表明对照池塘中的细菌种群变化较小。

2. 3 DGGE 条带的系统发育学分析

DGGE 胶上通过割胶回收再次 PCR 扩增此片段，测序，共有 38 个条带能得到扩增产物，在NCBI BLAST 对得到的 38 个条带序列相似性分析，条带 33 与数据库中 HQ661264. 1 序列具有较低相似性( 91%) ，其余条带与数据库中的相应序列有较高的相似性，均在 95% ～100%。38 个条带获取的相似序列构建系统发育树如图 2。这些序列分布于 5 个已知的门。有 7 个条带代表的细菌种群组成厚壁菌门，5 个条带组成放线菌门，3 个条带组成蓝细菌门，而条带 24 代表拟杆菌门，其余 22 个条带构成变形杆菌门。变形杆菌门中，β － 变形杆菌纲 12 条，为最优势类群，γ－ 变形杆菌纲种群有 5 个条带，α － 变形杆菌纲有3 个条带，条带 4 和 5 组成 δ － 变形杆菌纲种群。

2. 4 施肥对细菌种群及其相对丰度的影响

施肥和对照池塘细菌种群组成相对丰度见图3。放线菌门、厚壁菌门和 α 和 β － 变形杆菌纲等种群出现在所有池塘中。池塘在施化肥后第 2 天新检测到拟杆菌门、蓝细菌门和 γ － 变形杆菌纲等种群; 第 4 天未检测到拟杆菌门种群，但蓝细菌门、β － 和 γ － 变形杆菌纲等种群的相对丰度增加，厚壁菌门和放线菌门等种群的相对丰度明显下降; 第6 天未检测到 δ － 变形杆菌纲等种群，而检测到拟杆菌门种群，厚壁菌门种群的相对丰度比第 4 天增加，蓝细菌种群的相对丰度下降。施有机肥池塘在第 2 天新检测到拟杆菌门种群，γ － 变形杆菌纲种群的相对丰度增加，而 β － 变形杆菌纲种群的相对丰度略下降; 第 4 天新检测到蓝细菌门种群，γ －变形杆菌纲等种群的相对丰度更低，而厚壁菌门种群的相对丰度增加; 第 6 天未检测到 γ － 和 δ － 变形杆菌纲等细菌种群，厚壁菌门种群的相对丰度增加到最高。施肥对 α － 变形杆菌纲种群影响极小，以及对照池塘细菌种群和相对丰度变化不大。

3 讨论

施入水体的化肥为易溶于水的碳酸氢铵，同时铵态氮( NH4+－ N) 可以转化为硝态氨 ( NO3－－N) ，而亚硝态氮( NO2－－ N) 是转化的中间形式。磷酸盐( PO43 －－ P) 为易溶的磷酸一铵，因此，施肥后 NH4+－ N、NO3－－ N、NO2－－ N 和 PO43 －－P 都是在第 2 天含量达到高峰，之后被浮游藻类吸收利用而逐渐下降，这与朱爱民等［14］的报道一致。化肥能促进浮游藻类生长，而藻类通过光合作用释放大量氧气，水体溶氧增加，丰富的浮游生物也降低了水体透明度。而有机肥中有机质发酵释放出来的 N、P 含量有限，NH4+－ N、NO3－－ N、NO2－－ N 和 PO43 －－ P 含量增加幅度没有化肥明显，浮游藻类增加不如化肥，而且有机肥会培育大量的浮游动物摄食浮游藻类，同时有机质发酵还会消耗水体中的溶氧导致水体溶氧比对照组更低。施有机肥的池塘由于富含有机质，适合细菌、真菌等微生物快速繁殖生长，因此，施有机肥的水体细菌总数明显高于施化肥和对照组，水体的透明度低于对照组。有机肥发酵产生部分有机酸导致 pH 值下降，这与周本翔［2］的研究报道基本一致。PCR － DGGE 是一种快速、可靠的检测微生物群落结构组成的分子生物学方 法［4，8，15］，根 据DGGE 原理，每一个 DGGE 条带代表一种微生物种群或一个可操作单元［16］。本研究利用该技术在不同样品中均检测到丰富的 DGGE 条带数，说明池塘中存在丰富的细菌种群，不同处理池塘中均存在厚壁菌门、放线菌门以及变形杆菌门中的α － 、β－ 变形杆菌等优势种群，与 Glockner 等［17］、郑小红等［18］等报道水体、湖泊的优势种群组成相似。王晓丹等［19］报道密云水库细菌种群随着季节发生变动，表明池塘或水库中的细菌种群会随着环境变化而改变。本研究表明施肥对池塘中细菌种群有明显的影响，施肥能提高 N、P 含量，同时蓝细菌在施化肥后第 2 天、施有机肥后第 4 天成为优势种群，氮、磷含量高的富营养水体易导致蓝细菌暴发［20 －21］。在施肥后的池塘中均检测到拟杆菌门细菌种群，说明施肥能促进拟杆菌门细菌种群的生长，因为拟杆菌是粪便污染的主要标志之一［22］，拟杆菌门种群也是富营养化水体中的优势种群［18］。厚壁菌门种群是广泛存在于水体中的一类细菌类群，郑小红等［18］研究发现厚壁菌门种群是玄武湖微囊藻水华时期水体内主要优势群之一。本研究表明有机肥能促进厚壁菌门种群的生长，到第 6 天达到最高，厚壁菌门中以芽孢杆菌属、产乳酸杆菌属、梭菌属等菌群为主，与解开治等［23］研究发现猪粪在腐熟发酵过程中优势菌群为梭菌属、芽胞杆菌属等相一致; 施化肥后厚壁菌门种群的相对丰度先逐渐降低，到第 4 天最低，而第 6 天又逐渐升高，说明化肥会抑制厚壁菌门种群的生长。施化肥后第 4 天和 6 天 β － 和 γ － 变形杆菌纲种群的相对丰度明显高于其它处理池塘，而放线菌门种群的相对丰度最低，这可能与化肥中高含量的 NH4+－ N有利于 β － 和 γ － 变形杆菌纲中的亚硝化细菌和硝化细菌类群的生长，却抑制放线菌门细菌种群的生长，说明放线菌门种群受化肥影响，α － 变形杆菌纲出现在所有池塘中，且其种群相对丰度变化不大，说明不受施肥影响。对照池塘虽未施肥，但池塘中本身存在的有机淤泥、水生动植物和微生物等每天也存在一定程度变化，进而会影响到其中的细菌种群，但变动幅度没有施肥池塘明显。刘桂婷等［4］研究发现施肥对细菌多样性及群落结构有影响，本研究说明施肥能增加细菌种群结构多样性指数，施化肥后第 2 天多样性指数最高，施有机肥多样性指数在第 4 天最高，之后均逐渐下降，分析可能是化肥速效能快速促进浮游藻类和部分微生物生长，而后随着 N、P 营养成分含量下降，细菌种群多样性指数降低; 而施有机肥后，大量富营养微生物快速生长，群落多样性增加，随着时间延长，部分细菌种群逐渐成为优势种群，细菌群落多样性又逐渐降低并趋于稳定，接近最初的原始状态。施肥能明显增加细菌种群丰富度，肥料中含有的营养成分有利于水体中部分细菌种群生长成为优势种群，增加水体中的细菌种群，有机肥营养成分更丰富，肥效维持时间更长，细菌种群丰富度增加更明显和持久。