南极磷虾原肌球蛋白纯化鉴定、理化特性及模拟表位肽预测

原肌球蛋白（TM）存在于除植物以外的所有真核细胞中，被证明是一种交叉反应过敏原，在无脊椎动物家族中被认为是泛变应原，在虾等多个物种中被确定为主要过敏原。它是一种高度保守蛋白，平均长度约为284 个氨基酸残基，由两个平行的α-螺旋组成，分子质量约34～38 kDa。TM是引起食物性过敏反应的第三大常见原因。

大连工业大学食品学院的王 珊、孙 娜*等以南极磷虾（Euphausia superba）为主要研究对象，通过除肌浆蛋白、丙酮除脂、蛋白粗提、热处理除杂、等电点沉淀、硫酸铵盐析等多个步骤对其进行提取纯化；利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和超高效液相色谱-串联质谱联用（UPLC-MS/MS）技术对目的蛋白进行相关鉴定；对南极磷虾TM进行热稳定性实验、pH值稳定性实验和体外模拟胃肠消化实验；根据欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息研究所（EMBL-EBI）分析比对不同甲壳动物TM的氨基酸序列同源性；同时结合5种常用的生物信息学分析工具对南极磷虾TM模拟表位肽进行预测，并利用SWISS-MODEL服务器对其空间结构进行同源建模；最终通过PyMOL软件将预测出的候选表位在其空间结构上进行一一映射。

1、南极磷虾TM的提取纯化分析

如图1所示，南极磷虾肉经磷酸缓冲液去除肌浆蛋白、丙酮溶液除脂、抽提液粗提、热处理除杂、等电点沉淀、硫酸铵盐析等多步提取纯化操作，不断去除杂条带。根据泳道6目的蛋白条带与Marker条带的比对发现，最终仅在32 kDa附近得到单一条带。利用Image J软件对其进行灰度扫描分析，得到提取纯化的蛋白纯度达93.24%。研究表明，TM分子质量约34～38 kDa，等电点约4.5，是一种对热稳定的蛋白。因此，经一系列提取纯化后最终在32 kDa附近得到的蛋白条带很可能是南极磷虾TM。

2、目的蛋白UPLC-MS/MS分析

如图2所示，根据MS扫描结果初步确定目的蛋白的肽段数量及出峰位置，进而对所得肽段进行MS/MS扫描确定其氨基酸序列，共鉴定到89 条肽段，通过数据库检索发现该89 条肽段均属于UniProt数据库中收录的A7VKE0蛋白（E. superba，TM），将鉴定到肽段的氨基酸数目与该蛋白总氨基酸数目相比得到其肽段覆盖率达97%，从而确定提取纯化得到的目的蛋白为南极磷虾TM，登录号为A7VKE0，蛋白分子质量为32.6 kDa。

3、南极磷虾TM性质分析

南极磷虾TM热稳定性分析

由图3a可知，温度由20 ℃逐渐升至100 ℃的过程中，TM条带保持稳定，均未发生降解，也无其他新的条带生成。荧光光谱技术用于检测蛋白内源荧光，通过分析光谱峰位、强度等变化进而推断蛋白质三级结构的变化。

由图3b可知，随温度的升高，南极磷虾TM在295 nm波长处的荧光强度逐渐增强。温度由20 ℃升至60 ℃的过程中，荧光强度变化幅度不大；值得注意的是当温度升至70 ℃时，荧光强度有较大程度提升；加热至80 ℃时，荧光强度明显增强，且直至上升至100 ℃时，荧光强度逐渐达到峰值，此间变化不再明显。这说明随着温度的升高，南极磷虾TM高级结构逐渐伸展，温度上升至70 ℃时，其内部疏水区域暴露可能增多，加热至80 ℃时，TM多肽链进一步伸展，使得疏水基团暴露程度大幅提高，荧光强度明显增强。圆二色光谱技术被广泛应用于分析蛋白质的二级结构组成和变化。

由图3c可知，南极磷虾TM在190 nm波长附近有一正谱带，在208 nm和222 nm波长附近有两个负谱带，且在温度为20 ℃时其椭圆度绝对值最大；随着加热温度的升高其椭圆度绝对值逐渐减弱，说明α-螺旋相对含量逐渐降低；然而，加热温度超过80 ℃的TM冷却至室温后其椭圆度绝对值又有一定幅度的增强。

由图3d可知，南极磷虾TM主要由α-螺旋和少量无规卷曲结构组成；加热温度由20 ℃逐渐升至60 ℃时，α-螺旋相对含量逐渐降低，无规卷曲含量总体呈升高趋势，但变化幅度较缓；当温度升至70 ℃时，α-螺旋相对含量明显下降至最低，此时β-折叠相对含量明显增加；加热至80 ℃时，其结构组成与70 ℃时变化不大，无规卷曲相对含量最多，说明此温度下TM二级结构较为松散；值得注意的是加热温度自80 ℃后，α-螺旋相对含量略有回升，说明经高温加热冷却后，TM的α-螺旋结构有一定恢复。

南极磷虾TM的pH值稳定性分析

由图4a可知，pH值由1.0逐渐升至13.0的过程中，TM条带始终稳定存在，在其下方均没有生成其他小分子降解条带。

由图4b可知，pH 5.0时，TM的荧光强度最强；pH值升至7.0时，荧光强度略有下降；随着pH值向更酸/碱的方向变化，荧光强度逐渐降低，且碱性条件下荧光强度较酸性条件下更低。这些说明南极磷虾TM在pH值接近其等电点（pH 4.5）时结构较稳定，经酸/碱处理后可能导致发色基团暴露的微环境发生变化，TM结构可能发生部分聚集或折叠，使部分氨基酸残基被包埋，且pH值偏离等电点程度越大其结构变化越严重，因此导致荧光强度的改变。

由图4c可知，pH 5.0时，TM在208 nm和222 nm波长处的椭圆度绝对值最大；经酸/碱处理后，椭圆度绝对值逐渐减弱，说明α-螺旋逐渐减少，蛋白构象发生改变。

由图4d可知，pH 5.0时，南极磷虾TM的α-螺旋相对含量最高，且结构仅由α-螺旋和少量无规卷曲组成；当pH值向酸/碱方向变化时，α-螺旋相对含量逐渐降低，β-折叠和无规卷曲逐渐增多；pH 13.0时，还出现了少量β-转角结构。

南极磷虾TM的体外模拟胃肠消化稳定性分析

由图5a可知，南极磷虾TM在模拟胃液消化2 min开始出现降解，消化5 min时，出现较明显的降解条带；随着消化反应的进行TM条带逐渐变浅下移，随之产生一系列小分子降解条带，多集中于17～20 kDa之间；消化至120 min时，TM条带仍未完全降解。

由图5b可知，随着模拟胃液消化反应的进行，TM在295 nm波长处的荧光强度在消化0.5 min时出现上升而后逐渐降低，在355 nm处产生一新峰，且荧光发射波长出现红移。说明在胃消化反应初期，TM构象可能发生伸展导致部分疏水区域暴露，随着消化时间的延长，其结构又重新且不断折叠变化，在此过程中可能有新的芳香族氨基酸侧链暴露出来。

由图5c可知，TM在190 nm波长附近的峰的椭圆度逐渐降低，且在208 nm和222 nm波长处的峰的椭圆度绝对值逐渐减弱，说明α-螺旋不断减少。

由图5d可知，随着模拟胃液消化，TM的α-螺旋相对含量整体呈下降趋势，β-折叠相对含量整体呈增加趋势，无规卷曲含量总体变化不大。这说明TM经胃液消化后蛋白结构发生部分折叠，但二级结构总体组成变化不明显。

由图6a可知，南极磷虾TM在随即进行的模拟胃-肠消化反应中被进一步降解，生成一系列分子质量更小的降解条带，主要集中在11～20 kDa之间；消化反应进行到60 min时，TM条带开始变得模糊；消化至120 min时，TM几乎被消化完全，条带基本消失。

由图6b可知，在模拟胃-肠消化反应初期，TM在295 nm波长处的荧光强度迅速大幅降低，随后在295 nm和355 nm波长附近的荧光强度也不断下降，且在355 nm波长处出现轻微红移。表明TM在胰/糜蛋白酶作用下发生高度水解产生一系列小分子肽段，其结构迅速发生改变，而后这些水解肽段可能在分子相互作用下又重新形成聚集体掩埋了部分荧光发色基团，从而导致荧光猝灭；同时，构象改变又可能使部分新的芳香族氨基酸残基暴露引起红移。

TM模拟胃-肠消化的圆二色光谱图显示出明显改变，如图6c所示：自消化0.5 min起，在208 nm和222 nm波长处的双负峰带消失，转为在200 nm波长附近的单负峰带，且谱线总体有蓝移的趋势。这说明经模拟胃-肠消化后，南极磷虾TM的α-螺旋结构完全消失、β型结构增加，且体系的亲水性降低、疏水性增高。

由图6d可知，南极磷虾TM刚进入模拟胃-肠消化体系时，α-螺旋结构就被完全破坏并消失，无规卷曲和β-转角结构增多；β-折叠在整个消化过程中经历了减少-增加-减少等的动态变化，最终完全消失。这说明经过模拟胃-肠消化，南极磷虾TM的二级结构有序性降低，消化过程中结构发生动态变化，最终仅由大量无规卷曲和部分β-转角结构组成。

4、南极磷虾TM氨基酸序列同源性分析

如图7所示，南极磷虾TM与太平洋磷虾TM的序列同源性高达98.2%，与斑节对虾、凡纳对虾等其他虾的TM序列同源性多数在88%以上，而与锯缘青蟹、腐食酪螨、水蚤等序列同源性稍低，分布在82%～88%之间。很多研究发现甲壳类动物TM具有高度保守的氨基酸序列，同源性在88%～100%，这种高度的序列同源性很可能正是甲壳类物种之间临床交叉反应发生频率高的原因。

5、生物信息学预测南极磷虾TM模拟表位肽

表1列出了各生物信息学工具预测出的过敏原表位区域。然而，每种软件单独使用时都会有一定的局限性，因此，综合分析5种生物信息学工具的预测结果，同一表位被识别的软件越多，则其准确性可能越高，将不少于3种工具共同预测出的过敏原表位确定为南极磷虾TM候选模拟表位肽，如表2所示。共筛选得到8 条南极磷虾TM线性模拟表位肽序列，分别为EAQNKETNAKADKADDEVH、DLERSEERLN、TKLAEASQAADESER、EADRKYDE、ERAEERAEAG、VSEEKANQREEAYKEQI、RSVQKLQKEVDR、VNEKEKYKGI。

具体表位信息如表3所示。对比发现，不同甲壳类TM间具有相似的表位序列，这很可能是它们彼此间具有高度过敏交叉反应性的原因之一。本研究预测得到的南极磷虾TM模拟表位肽与这些已经验证的甲壳类TM抗原表位相比显示出了较高的重叠率，对于其中部分表位序列具有高覆盖率，这说明本研究的预测结果可能具有较高的准确性；但对于模拟表位肽中某些氨基酸的组成及序列长度等方面与这些已被鉴定出的抗原表位仍具有一定差异。

6、南极磷虾TM空间结构建模及模拟表位肽映射分析

如图8所示，通过SWISS-MODEL服务器对南极磷虾TM进行同源建模，采用序列近似度达55.99%的1c1g.2.A为模板，最终预测得到由两条肽链平行缠绕而成的α-螺旋构型的南极磷虾TM空间结构（图8a）。通过服务器自带的Structure Assessment模块对建模得到的TM空间结构稳定性进行评价，结果显示高达98.05%骨架的φ角和ψ角分布于可靠区，仅有0.53%分布于异常区（图8b）。因此，预测的南极磷虾TM空间结构模型是稳定可靠且具有高质量。

南极磷虾TM模拟表位肽映射结果如图9所示。利用PyMOL软件将生物信息学工具最终预测出的南极磷虾TM的8 条模拟表位肽在其空间结构对应位置一一进行映射，可以看出候选模拟表位肽均匀分布在整个蛋白质中，且多位于α-螺旋内。

结论

本研究提取纯化得到了较为纯净的南极磷虾TM；同时利用多种生物信息学工具对其模拟表位肽的预测，不仅进一步增加了研究者对南极磷虾TM过敏原的认识，也极大程度上提高了结果的准确性；通过对其空间结构的预测及模拟表位肽的映射为过敏原表位的定位缩小了范围，使得定位更加精准。本研究为未来基于南极磷虾TM表位的相关研究提供了科学参考，不过对其准确的过敏原表位及其致敏性评价还需进一步实验验证。