论文：克氏原螯虾体表固着类纤毛虫种类调查及硫酸锌对其药效研究

克氏原螯虾体表固着类纤毛虫种类调查及硫酸锌对其药效研究

王建国1，冯亚明2，王洲1，顾海龙2,陆宏达3，王权1

(1.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300；2.泰州市农科所，江苏泰州225300；3.上海海洋大学，上海201306)

摘要：调查克氏原螯虾(Procambarus clarkii)容易感染的固着类纤毛虫种类，并挑选寄生虫种类较单一的寄生部位分割成若干小块，分别放入不同浓度硫酸锌溶液，观察硫酸锌对固着类纤毛虫的药效。结果显示：容易感染克氏原螯虾的种类主要有钟虫、聚缩虫、累枝虫及莲蓬虫。硫酸锌对这几种虫体的24 h和48 h的LC50分别为5.63和2.18 mg/L、5.01和2.44 mg/L、6.28和2.93 mg/L、3.23和1.72 mg/L，对硫酸锌敏感度莲蓬虫>钟虫>聚缩虫>累枝虫。结果表明硫酸锌对克氏原螯虾常见固着类纤毛虫病有效。

关键词：硫酸锌；克氏原螯虾(Procambarus clarkii)；固着类纤毛虫；药效

克氏原螯虾(Procambarusclarkii) ,又称红色沼泽螯虾、小龙虾，属甲壳纲十足目螯虾科原螯虾属。原产于墨西哥北部和美国南部， 20世纪初传入我国，是目前国内外市场极为热销的淡水虾类之一。养殖规模逐年扩大，逐渐成为研究和开发的热点[1]。固着类纤毛虫病是甲壳动物容易罹患的疾病，附着在受精卵体表会妨碍卵的发育；大量附着在虾苗和成虾的鳃上时，影响鳃丝的气体交换，会引起缺氧而窒息死亡[2]；大量附着于体表和附肢上，形成许多棕色或黄绿色绒毛，头胸甲发黑，体表黏液增多，全身粘满污物，会妨碍虾的活动、摄食和蜕壳，影响生长[3-4]。除此之外还会感染贝类[5]、鱼类[6]、龟鳖等其他动物[7-8]。由于其繁殖快，种类多[9]，防治难度大，对水产动物危害严重。目前国内外学者已经开展了分类、生理、繁殖、生态方面的研究[1-7]，探讨了防治方法，但是许多实用有效的药物已经列为禁药[2,7-8,10-17]，在生产中无法使用。硫酸锌是一种较为安全的重金属盐类杀虫剂，已经在生产中用于防治固着类纤毛虫疾病，但是该药对不同种类固着类纤毛虫杀虫效果究竟如何缺乏有说服力的实验数据。本实验选择克氏原螯虾为研究对象，调查了寄生其体表的纤毛虫种类，选择优势种进行了硫酸锌产品的杀虫效果，试验为水产养殖科学用药提供参考依据。

1材料和方法

1.1固着类纤毛虫采集

从菜市场及里下河地区野外河道采捕克氏原螯虾样品作为调查对象。采用显微镜活体观察和染色法[18]观察体表及鳃上的固着类纤毛虫，按中国动物志无脊椎动物原生动物门的分类检索表进行分类。

1.2硫酸锌对固着类纤毛虫的药效实验

挑选寄生虫种类较单一，寄生密度较大的虾，小心地将其寄生部位分割成若干小块备用。实验在直径为12.5 cm的培养皿中进行，实验水体80 mL，水温(22±2)℃，pH7.5～8.0，硬度约为120 mg/L，实验药液每2 h更换一次。根据预实验结果设置6个实验组和空白对照组，充气72 h以上的自来水配制不同浓度的硫酸锌溶液(国药，分析纯)，空白对照组只加曝气自来水不加药物。每组分别放入相同数量的寄生虫组织块，每浓度10块。每2 h用解剖镜(OLYMPUS)观察1次寄生虫的存活情况，做好记录。虫体死亡判断的标准为纤毛停止摆动，伸缩泡不运动，内部原生质略模糊，其中累枝虫头部脱落，纤毛停止摆动，紧缩，伸缩泡不运动，内部原生质略模糊，固着柄肌丝断裂才判断为死亡。虫体存活情况观察方法为任意挑选5个组织块，每组织块任选一个视野，计数虫体总数量和死亡数量求取平均数，虫体死亡率计算方法为：死亡率=死亡数/总数×100%。

1.3数据分析

实验数据采用EXCEL2007求取平均值，数值采用平均值±标准差表示。虫体24 h和48 h的LC50采用Martin等的软件计算[19]。

2结果

2.1寄生纤毛虫种类调查

实验分别从5个菜市场和野外10个河道共采集了有固着类纤毛虫的克氏原螯虾54只。纤毛虫在虾体大量寄生后，呈“绒毛”状，由于摄取的食物不同纤毛虫颜色有微绿色、黄色或灰白色。根据在显微镜下对克氏原螯虾样品上的固着类纤毛虫的观察情况，按中国动物志无脊椎动物原生动物门的分类检索将固着类纤毛虫进行分类，结果见表1。共鉴别出10种纤毛虫，主要为寡毛纲的固着亚目和动基片纲的吸管目的种类。固着亚目的种类8种，分别是钟形虫、独缩虫、聚缩虫、拟单缩虫、累枝虫、杯体虫、靴纤虫、鞘居虫；吸管虫2种，分别是壳吸管虫和莲蓬虫。寡毛纲的固着亚目出现的几率远多于动基片纲的吸管目。

表1　克氏原螯虾体表固着类纤毛虫调查结果

纤毛虫中出现频率高的为钟虫、累枝虫、聚缩虫、莲蓬虫。钟虫(VorticellaLinnaeus)为固着亚目钟虫属种类，虫体均为单体生活而不形成群体，具有螺旋收缩的柄，银线系统为条纹状[20]。聚缩虫ZoothamniumBory de St.V incent，属固着亚目聚缩虫属，虫体均为群体生活，具有相互连接且延伸至柄基部的柄肌与“Z”形收缩的柄，银线系为条纹状[21]。累枝虫EpistylisEhernberg，属固着亚目累枝虫属，虫体均为群体生活，具有相互连接的柄，但柄内无肌丝，其个体特征与聚缩虫相似，银线系为条纹状。动基片纲中的种类，以单体分散分布，生物量远不及寡毛纲类纤毛虫，常和寡毛纲纤毛虫一起出现，很少见到单纯的动基片纲纤毛虫大量爆发。

2.2硫酸锌对固着类纤毛虫的药效

2.2.1硫酸锌对钟虫的药效

克氏原螯虾体表的钟虫在不同硫酸锌浓度和浸泡时间内死亡情况见表2。硫酸锌浓度较低时钟虫几乎不受影响，随着浸泡时间增加死亡程度逐渐变大。在相同浸泡时间内，硫酸锌浓度越大，虫体出现中毒死亡率越高。用药4 h时，7.75 mg/L浓度有10%的虫体失去活性，15.5 mg/L时有约30%失去活性。浸泡16 h时,1.94 mg/L有约5%失活，3.88 mg/L有15%失活，15.5 mg/L死亡率达到63%。用药24 h内0.48 mg/L出现少量死亡，15.5 mg/L死亡率达到78%。48 h内1.94 mg/L死亡率达到52%，低于0.48 mg/L几乎无显著杀虫效果，但该浓度可能对虫体有抑制作用。根据实验数据计算硫酸锌杀灭种虫24 h和48 h的LC50分别为5.63 mg/L和2.18 mg/L。

表2　硫酸锌对钟虫的杀虫效果

对照组钟形虫虫体口缘纤毛剧烈摆动，形成强大的回旋水流，可观察到食物泡和收缩泡的运动，虫体对刺激敏感，碰到异物后口缘纤毛立即停止摆动，缩回体内，固着柄迅速收缩，呈折线状，随后口缘纤毛伸出继续摆动，固着柄伸直。出现中毒症状时，虫体口缘纤毛活动减弱，口盘周围形成的水流减小，并不断出现收缩反应。随硫酸锌浓度增大、浸泡时间加长中毒程度越深，口缘纤毛停止摆动，缩回体内，体内的食物泡和收缩泡活动逐渐减弱直至停止后即死亡。

2.2.2硫酸锌对累枝虫的药效

克氏原螯虾体表累枝虫在不同硫酸锌浓度和浸泡时间内死亡情况见表3。累枝虫呈群体生长，群体分枝常呈树状。运动时肌柄不能收缩，活动能力较差，肌柄内肌丝清晰可见。对照组累枝虫在试验期间活力旺盛，口盘处的纤毛不停摆动，食物泡和伸缩泡不停活动。硫酸锌浓度低于0.2 mg/L时累枝虫几乎无任何异常。浸泡4 h后4.04 mg/L以上浓度组的累枝虫逐渐开始表现中毒症状，口盘纤毛摆动减弱，最后停止摆动，收回口盘，但食物泡和伸缩泡仍不停活动。随浸泡时间延长食物泡和伸缩泡逐渐停止活动，虫体部原生质略模糊，一段时间后头部从附着柄上脱落，肌丝逐渐断裂成数段。浸泡4 h，4.04 mg/L以上浓度组累枝虫开始出现死亡，20.19 mg/L时死亡率约30%。16 h内2.02 mg/L有8%虫体失活，20.19 mg/L死亡率达60%。24 h内0.81 mg/L有5%虫体失活，4.04 mg/L时死亡率达到45%，20.19 mg/L死亡率达90%。48 h内0.81 mg/L有15%虫体失活，2.02 mg/L死亡率达到50%。根据实验数据计算硫酸锌杀灭累枝虫24 h和48 h的LC50分别为5.01 mg/L和2.44 mg/L。

2.2.3硫酸锌对聚缩虫的药效

克氏原螯虾体表的聚缩虫在不同硫酸锌浓度和浸泡时间内死亡情况见表4。对照组聚缩虫口盘处的纤毛不停摆动，食物泡和伸缩泡不停活动，当有一个单体遇到外界刺激时，同一个主枝的所有单体迅速收缩。当受到环境毒物的影响时虫体活力减弱，并逐渐收缩，最后缩成一团而死亡。该虫的形态和单缩虫及累枝虫不同。硫酸锌浓度低于0.20 mg/L聚缩虫未发现异常。浸泡4 h内4.04 mg/L以上浓度组聚缩虫开始出现死亡，20.19 mg/L有35%停止活动，缩成一团。浸泡16 h时2.02 mg/L开始出现死亡，8.07 mg/L死亡率达到28%，20.19 mg/L达到68%。浸泡24 h时0.81 mg/L开始出现死亡，8.07 mg/L组死亡率达到60%。浸泡48 h时0.81 mg/L死亡率达到15%，2.02 mg/L浓度死亡率40%，20.19 mg/L有95%死亡。根据实验数据计算硫酸锌杀灭聚缩虫24 h和48 h的LC50分别为6.28 mg/L和2.93 mg/L。

表4　硫酸锌对聚缩虫的杀虫效果

2.2.4硫酸锌对莲蓬虫的药效实验结果

克氏原螯虾体表的莲蓬虫在不同硫酸锌浓度和浸泡时间内死亡情况见表5。硫酸锌浓度低于0.24 mg/L时莲蓬虫几乎不受影响。0.24 mg/L时浸泡48 h以上对莲蓬虫有一定抑制作用。浸泡4 h时1.94 mg/L有少量死亡，15.5 mg/L有60%收缩成一团。16 h时0.48 mg/L组有少量缩成一团，7.75 mg/L浓度死亡率达50%，15.5 mg/L死亡率达85%。24 h内0.48 mg/L死亡率约15%，7.75 mg/L以上浓度80%以上死亡。48 h内0.24 mg/L组有少量虫体死亡，7.75 mg/L以上浓度90%死亡。莲蓬虫中毒后口缘纤毛收回，缩成一团，食物泡逐渐停止活动，然后死亡。莲蓬虫对硫酸锌毒性相对较敏感，0.24 mg/L以上浓度对虫体有一定抑制作用或杀灭效果。硫酸锌杀灭莲蓬虫24 h和48 h的LC50分别为3.23 mg/L和1.72 mg/L。

表5　硫酸锌对莲蓬虫的杀虫效果

3讨论

固着类纤毛虫分布广，其附生谱广，可感染贝类[5]、甲壳动物[9]、鱼类[6]及龟鳖[7-8]，甚至在水草、树枝[22]等表面均能生长。在水产动物的寄生部位通常为鳃和表皮。虽然固着类纤毛虫可在许多动物及植物上生长，但是对固着基存在一定选择性，水产动物卵、幼体、体壳及体表受损部位易被附着，使其最容易罹患固着类纤毛虫病，常造成严重的经济损失。Mayén-Estrada等[23]对墨西哥地区克氏原螯虾体表及鳃上15种缘毛类纤毛虫进行调查，发现不同种类纤毛虫对寄生部位有选择性，其中14种选择附生于步足和腹足上，1种选择性寄生在鳃上。不同种类的水产动物附生的固着类纤毛虫种类不完全相同，其中报道最多，危害最严重的主要有钟虫、独缩虫、聚缩虫、累枝虫及杯体虫[24]等，靴纤虫、鞘居虫、壳吸管虫及莲蓬虫等附生密度相对较小[16-17]，很少单独大量爆发，所以本研究挑选的实验对象为既容易感染克氏原螯虾又容易感染其它甲壳动物的种类，具有广泛的代表性。

由于固着类纤毛虫危害多种水产动物健康，尤其对幼苗影响极大[3]，国内外学者尝试了很多种方法来防治。换水法，固着类纤毛虫主要以悬浮的有机物、细菌等为食，所以一些学者通过换水以降低有机物、细菌等含量或刺激甲壳动物蜕壳的方法防治[10]。但是也有人对此方法提出了异议，当固着类纤毛虫已经大量存在时，大量换水，环境改变的刺激会使其释放大量的游泳体，游泳体在约2 h内便能附着，因此仅采取换水而不采取其它措施的话，换水可能使病情更加严重[2]。药物防治，甲壳动物生长过程中要蜕皮，施用10～15 mg/L茶籽饼[11]，促进甲壳动物蜕壳然后大量换水排掉有虫附着的甲壳来防治，能起到一定效果，但不久后容易复发[12]，且对鱼类无效。

许多学者在探寻能直接杀灭固着类纤毛虫的药物，发现抗生素、漂白粉、EDTA、生石灰及冰醋酸等防治效果不明显，而食盐[7]、制霉菌素[13]、孔雀石绿[14]、一些消毒剂[12]、代森类农药、重金属盐类[15]及某些中草药[16]等对固着类纤毛虫有一定疗效。这些药物在实际应用中大多存在一些问题，如：食盐仅适于小水体高浓度浸泡，孔雀石绿、硝酸亚汞等是致畸致癌物质已被禁用，其它有一些杀虫效果不稳定，高锰酸钾对中国对虾体表聚缩虫有效，但对河蟹体表聚缩虫无效[16]。硫酸锌及其复配制剂作为一种重金属盐类杀虫剂，在水中生成的锌离子易与虫体细胞蛋白质结合成蛋白盐而失活沉淀，当锌离子与虫体细胞酶的巯基相结合后就失去了活性，从而达到杀灭的目的，目前此类制剂是抗纤毛虫的主要药物之一。

本实验对常见的四种纤毛虫钟虫、聚缩虫、累枝虫及莲蓬虫在不同硫酸锌浓度中浸泡时的死亡情况进行研究，发现四种纤毛虫硫酸锌中毒后的死亡情况存在一些共同特征：硫酸锌浓度低于0.2 mg/L时，几乎所有纤毛虫都不受影响；硫酸锌浓度越大，死亡率越高，随着浸泡时间的增加死亡率逐渐变大。在用药24 h内，硫酸锌对虫体LC50分别是钟虫2.18 mg/L，累枝虫2.44 mg/L，聚缩虫2.93 mg/L，莲蓬虫1.72 mg/L，出现药效的浓度分别是钟虫0.48 mg/L，累枝虫0.81 mg/L，聚缩虫0.81 mg/L，莲蓬虫0.24 mg/L，四种固着类纤毛虫对硫酸锌毒性的敏感性莲蓬虫>钟虫>累枝虫>聚缩虫。低浓度硫酸锌浸泡下，虫体未见明显异常，但达到敏感浓度后浸泡48 h对虫体有一定抑制作用。主要表现在有的虫体伸缩泡收缩运动减少，分裂数量少，固着柄收缩量下降等。在高浓度组观察到累枝虫浸泡后虫体头部脱落现象，试验中观察了脱落的头部纤毛停止摆动，紧缩，伸缩泡不运动，内部原生质略模糊，固着柄肌丝断裂，可判断为虫体死亡。BAUFER等报道化学物质刺激[25]、Utz等[26]报道宿主的死亡、脱皮等外界刺激因素都能刺激虫体形成游泳体形式而脱离群体，但是宿主的受伤或不能游动却不能触发虫体形成游泳体。在宿主死亡后的7 h内，90%个体脱离宿主甲壳并在 2 h内形成游泳体形态，游泳体能在水中存活 14 h[27]，有足够的时间完成重新寄生的过程，这可能就是虾类苗种生产时，固着类纤毛虫越换水越多的原因。一些学者观察药物对虫体的作用单纯从虫体是否从柄部断裂来判断[17,28]，笔者认为不妥，因为钟虫等许多虫体和柄部连接处有一个较细的缢痕[29]，虫体受到刺激后很容易从此断裂，断裂后可能形成游泳体再次进行感染而不是死亡。

由此可以看出，在使用药物或者换水等方法来防治固着类纤毛虫病时低浓度药物对虫体的刺激可能加速虫体形成游泳体，出现虫越治越多的风险。生产中硫酸锌及其复配制剂用于防治水产动物固着类纤毛虫病已有很多年，有些虫体对药物产生了耐药性，目前说明书使用浓度在0.3 mg/L左右，可能无法有效起到杀灭固着类纤毛虫的目的，但可以刺激其虫体脱落。在使用药物防治固着类纤毛虫的过程中，使用有效浓度药物后24 h内进行换水，可能降低游泳体数量而减少疾病再次大规模感染的风险。

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