论文：棘胸蛙歪头病的病原分离鉴定与防治试验

棘胸蛙(Quasipaa spinosa)俗称石蛙、石鸡等，属蛙科、棘蛙属，其栖息地主要分布在我国南方各省的密林溪涧中。棘胸蛙肉质细嫩、味道鲜美，同时具有很高的药用价值，深受消费者的喜爱。随着自然资源量的下降，被世界自然保护联盟(IUCN)列为易危(VU)保护等级，是浙江省的重点陆生野生保护动物。人工养殖是促进棘胸蛙资源恢复和保护的重要举措，2020 年国家出台政策将棘胸蛙划归渔业部门按水生动物管理，其人工养殖也将会进入快速发展期。

在棘胸蛙养殖过程中，病害问题是制约其发展的瓶颈。尤其是一种以病蛙头部歪斜、白内障或蓝眼、在水中打转等症状的歪头病，因发病率、死亡率高，给养殖业造成了较大的经济损失。棘胸蛙歪头病的病原鉴定多为脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)，但是，我们在2020 年对发病棘胸蛙歪头病的病原分离中发现主要病原为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，结合攻毒试验表明，弗氏柠檬酸杆菌也能复制出歪头症状。我们对该病原进行了药物敏感性试验和室外治疗试验，以期为棘胸蛙养殖中该病的诊断与防治提供参考。

一、棘胸蛙歪头病症状

棘胸蛙歪头病在整个养殖季节都有发生，主要在6－8月。2020年8月2日我们从浙江遂昌获得病蛙，主要表现为头部歪斜、眼睛发白或出现蓝眼，解剖发现肝脏发黑、脾脏肿大、肠壁变薄透明、肠道空、肠内有少量淡黄色黏液(图1)。

图1 病蛙头部及解剖症状

二、病原分离鉴定

1.分离 将患病棘胸蛙进行剖检，无菌操作取肝、脾、肾、脑组织划线接种在大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)上，挑取单菌落28℃下进行纯化培养18～24小时，观察菌落及细菌形态特征。

2.攻毒 将获得的优势纯化菌株接种于TSA平板，28℃恒温培养24 小时，用0.8%的无菌生理盐水洗下，麦氏比浊法将细菌浓度调整为每毫升1.0×107CFU。健康棘胸蛙室内暂养5 天后，每只腹腔注射0.2 毫升，共10 只，对照组注射等量生理盐水。接种后每天观察棘胸蛙的临床症状和死亡情况，连续观察14天。

3.生理生化鉴定 生理生化鉴定采用梅里埃VITEK2 compact微生物全自动鉴定系统。

4.分子鉴定 采用TaKaRa 公司的16S rDNAPCR 扩增试剂盒提取菌株的DNA，采用扩增细菌的PCR通用引物，正向引物F：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，反向引物R：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。PCR 扩增反应条件：25 微升反应体系，每管依次加入10 微升Taq 酶、上下游引物各1 微升，模板1 微升，加超纯水10 微升。反应程序：94℃变性1 分钟，54℃退火1 分钟，72℃延伸1 分钟，30 个循环；72℃终延伸7 分钟。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。PCR 扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果与GenBank中已知核酸序列进行BLAST比对分析。

三、防控试验

防控试验选择敏感药物恩诺沙星，结合解毒促代谢和增强免疫的中药制剂应激宁、银黄可溶性粉、黄芪多糖进行内服治疗5～7 天。外用消毒药物选择以刺激性小的大黄流浸膏和复合碘混合液0.3毫克/升，每天1次，连用3次。

四、结果

1.病原鉴定 经对分离的优势菌进行攻毒试验，健康棘胸蛙7天内都发病死亡，其中有部分出现歪头、白内障等症状，但50%的发病死亡蛙未见明显症状。对致病菌进行形态特征观察，该菌落呈乳白色、不透明或半透明、凸起、边缘光滑整齐，恒温培养24 小时后菌落直径为1.0～3.0 毫米。经生理生化与分子鉴定，确定为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。

2.药敏试验 致病菌的药物敏感试验结果表明，该菌株对恩诺沙星、氟苯尼考、强力霉素高敏，对红霉素、新霉素中敏，对SMZ、青霉素、庆大霉素、头孢Ⅳ、利福平等耐药。

3.防控效果 8 月4 日开始，将10%恩诺沙星4克＋应激宁8克＋银黄可溶性粉2 克＋黄芪多糖0.5 克拌加1 千克黄粉虫，连续内服5 天，其中恩诺沙星为3 天；外用大黄流浸膏和复合碘混合液0.3 毫克/升，每天1 次，连续3 天；对投料区也进行泼洒消毒。8 月4 日当天死亡258 只，8 月 5 日 死 亡 220 只 ， 8 月 6 日 死 亡115 只，8 月 7 日死亡 84 只 ，8 月 8 日死亡12只，8月10日以后未见死亡病蛙，显示较好的治疗效果。

五、小结

棘胸蛙歪头病是棘胸蛙、黑斑蛙、牛蛙养殖中的常见病害，病原鉴定比较统一的是脑膜炎败血伊丽莎白菌，但不排除歪头为一种症状、多种病原引起。从实验室对不同来源的歪头病例检测发现，6－7 月送检的黑斑蛙歪头病还带有较为明显的肾脏囊肿，而8月送检的歪头病蛙则囊肿不明显，也显示出不一样的病理特征。

弗氏柠檬酸杆菌过去常常被认为是肠道致病菌，近年来发现，毒力较强的菌株可能穿过肠道黏膜，进而在全身扩散传播，引起机体系统感染，而不仅仅局限于肠道感染。患病棘胸蛙肠壁变薄、肠道黏膜免疫系统受损，可能促使了该病的发生。近年来，肝肠损伤导致的疾病非常普遍，在鱼类、两栖类报道较多，因此，我们考虑肝肠代谢问题可能是该病发生的一个关键诱因。由于棘胸蛙投喂的黄粉虫脂肪含量高，在水温适宜、投喂量加大以后，造成肠道和肝脏负荷增大，产生的大量自由基氧化造成肠黏膜和肝损伤，导致肠道变薄和肝脏颜色发黑等症状，机体的抗应激和免疫机能下降，从而促进各种病原微生物的感染。在治疗过程中添加应激宁和免疫多糖，可以缓解自由基损伤、增强机体免疫功能，并对肠壁修复有一定的效果。实践表明，控制投料、保持料台清洁、定期用中草药消毒剂消毒，该病害的发生就少，即使发病治疗的效果也较好。