芽孢杆菌发酵效果与适宜温度和ph值

益生菌具有促进动物生长、提高机体免疫能力等生理功能，常用作微生态饲料添加剂。菌体SFU-9是一株蜡状芽孢杆菌，该菌株在不利环境下能够以孢子形式存在，具有耐高温、耐酸碱和耐挤压等优点，较乳酸菌、酵母菌等益生菌更能保持活菌状态，适合饲料加丁业的需要。

该研究以菌株SFU-9进行实验，研究发酵温度、接种量、培养基初始pH值、溶解氧等因素对菌株生长的影响，确定出最佳培养条件为：培养基初始pH值为6.0~6.5，接种量5%(相对摇瓶装液量)，培养温度30-32℃，装液量28 ~33mL/250mL 。发酵液中的活菌数可达10的11次方cfu/mL。在此基础上，采用单因子和正交试验相结合的方法，确定出最佳发酵培养基组成为：玉米淀粉2.0%，啤酒酵母1.5%，NaH2PO40.2%，Na2HPO40.2%，玉米浆2.0%。以最佳培养基配方给菌体提供营养，在最佳培养条件下培养，可以使发酵液中的活菌数高达10的12次方cfu/mL。

由于抗生素等药物性饲料添加剂产生的药物残留、细菌耐药性等危害，人们将目光投向了无毒、无公害的微生态饲料添加剂的研究和开发。我国农业部1994年公布的能够用于生产微生态制剂的菌种有：乳酸杆菌、芽孢杆菌、粪链球菌、酵母菌和双歧杆菌。

芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱和耐挤压等优点，适合饲料加工业的需要，能够保持较高的活菌数。孢子进入肠道后，能够在肠道上部迅速复活而发挥生理生化作用，促进动物生长，提高机体免疫能力，该菌在饲料工业中的应用具有远大前景。所以，本实验选用了生产效率高、生产周期短的高密度深层液体发酵法培养菌株SFU-9，在摇床培养的条件下确定了适合蜡状芽孢杆菌SFU-9生长的最佳生长参数，在确定的最佳生长参数的基础上进行培养基优化的研究，使发酵液的活菌含量进一步提高达到10的12次方cfu/mL，为该菌的工业化生产提供了理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌种

SFU-9 菌株,本实验室提供。

1.2 培养基

1.2.1 斜面菌种培养基(W/V)(pH=7.0)

蔗糖 3.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏 1.0%，NaH2PO40.2%,Na2HPO40.2%，琼脂 2.0%；

1.2.2 液体菌种培养基(W/V)(pH=7.0)

蔗糖 3.0%、蛋白胨0.5%、酵母膏 1.0%，NaH2PO40.2%，Na2HPO40.2%；

1.2.3 摇瓶发酵培养基(W/V)(pH=7.0)

基本培养基:蔗糖 3.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏 1.0%，NaH2PO40.2%，Na2HPO40.2%；

1.2.4 活菌计数培养基(w/V)(pH=7.0)

蔗糖 3.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏1.0%，NaH2PO40.2%，Na2HPO40.2%，琼脂 2.0%；

1.3 培养条件

斜面菌种培养:30℃，恒温培养箱培养24h。

液体菌种培养：用Φ1mm的接种环取3环斜面菌种于液体培养基中，装液量30mL /250mL三角瓶，八层纱布封口，八层纱布封口,30~31℃，160r/min摇床培养16~18h，镜检菌体形态正常上无杂菌后备用。

摇床发酵：基本条件：装液量30mL/250mL三角瓶，接种量2%(瓶装液量)，八层纱布封口30℃，160r/min，培养时间16~18h。

活菌计数:30℃，恒温培养箱培养24h。

1.4 分析方法

pH值的测定：pH S-25型pH测定仪。

生物量测定：血球计数法和平板涂布法活菌计数。

2 结果与讨论

2.1 菌株SFU-9生长曲线

采用血球计数方法在发酵过程中每隔3h取一次样，直至33h时止。做出菌株的生长曲线如图1所示。

从图1可以看出，当培养时间达到15~18h左右时，菌种生长基本处于稳定期。

在20 ~25h时，有芽孢形成并大量产生孢子。该实验以菌体为目的产物，又因孢子具有耐高温、耐挤压和耐酸碱等性能，能够长时期保持活力，故从图中可知，该菌株的种龄为16~18h，发酵时间为21~24h。

2.2 培养温度

温度的高低与发酵中的酶反应速率、氧在培养液中的溶解度和传递速率等密切相关，从而影响菌体生长和产物合成。

本实验是在基本培养条件下，将培养温度由30℃改为分别在20，25，30，35，40，45℃下培养，采用活菌计数的方法测定发酵液中的活菌含量。菌株SFU-9的生长与温度的关系如图2示

从图2可以看出，该菌株的最佳生长温度是30~32℃。

2.3 发酵液初始pH值

在基本培养基的组成不变的前提下，将培养基的初始pH值由7.0分别调为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，然后接种培养。采用活菌计数方法测定发酵液中的活菌含量。pH值对菌株SFU-9的影响如图3示。

由此可知，当培养基的初始pH值为5.5~6.8时，发酵液中活菌含量超过10的11次方cfu/ml，该菌最适生长pH为6.0~6.5。

2.4 接种量

在基本培养条件前提下，改变接种量，使接种量分别为1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，采用活菌计数方法测定发酵液中生物量。

接种量与发酵液中活菌总数的关系如图4所示：结果表明当接种量为5%时，发酵液中的活菌总数最大，可达10的11次方cfu/mL。该研究的目的是取得最大菌体数，所以最佳接种量为5%

2.5 呼吸代谢对生长的影响

溶解氧是需氧菌发酵的必备条件，摇瓶装液量的多少直接影响氧的传递。本实验在基本培养条件前提下，改变装液量，使装液量分别为:15,20,25,30,35,40,45,50,55,60mL,然后接种培养。同样采用活菌计数方法测定发酵液中的活菌含量。菌株SFU-9对氧气的需求情况如图5所示。

从图中可知，装液量为28 ~ 33mL/250 mL时，发酵液中的活菌含量最高。

2.6培养基优化

2.6.1 碳源的优化

将基础培养基的碳源蔗糖3%分别用表1中的碳源代替，制成培养基后接种培养，用活菌计数方法测定发酵液中的活菌含量，结果见表1：

从表中可以看出，最适合蜡状芽孢杆菌SFU-9 生长的碳源是玉米淀粉，其次为土豆淀粉和可溶性淀粉。

2.6.2 氮源的优化

将基础培养基中的蛋白胨和酵母膏用表2中的物质替代配制培养基，用于发酵生产菌株SFU-9。

从表2可以得知有机氮源较无机氮源更有利于蜡状芽杆菌SFU-9的生长其中以啤酒酵母为最佳，豆粕粉、酵母膏效果次之。

2.6.3 无机盐的优化

将基础培养基中的NaH2PO4，Na2HPO4用表3中的无机盐代替配制培养基，研究无机盐对菌株SFU-9生长的影响，用活菌计数方法测定发酵液的活菌含量。

由此可知，无机元素磷是蜡状芽孢杆菌SFU-9生长所必需的元素，磷在菌体的核酸代谢、能量的贮存与传递方面起着重要的作用。同时，磷酸盐也是重要的缓冲剂。

2.6.4 生长因子的影响

玉米浆富含生长因子，本实验是在基础培养基的基础上添加玉米浆，研究其对菌株SFU-9的生长促进作用。

从图6可知，玉米浆对菌株的生长有促进作用，添加量以2~2.5%为最佳。

2.6.5 正交实验

培养基中各组分之间有一定的内在关系，为寻找它们之间最恰当的配比，在研究了碳源、氮源、无机盐和生长因子等单因子对菌株SFU-9生长的影响以后，采用正交实验的方法研究这些因素对菌株生长的综合作用，以进一步完善培养基中各组分的功能，提高发酵液的生物量。

以啤酒酵母、玉米淀粉、NaH2PO4+Na2HPO4和玉米浆作为发酵因素，每个因素各选取三个水平，并按L9(3的四次方)正交表设计9组摇瓶发酵实验，每组做两个平行。正交实验的因素与水平和实验结果分析见表 4。

由极差可知，C的极差最大，D的极差最小。极差越大，反映该因素水平变动时，总指标变化越大。也就是该指标对综合指标的影响越大。因此，按极差大小顺序排列出因素的主要顺序为C>A>B>D，据表4可知，菌株SFU-9最佳培养基配方为A2B2C2D2。

3 结论

由实验可知，培养基的初始pH值、接种量，培养温度、培养时溶氧情况的培养条件和培养基的组成对菌株的生长有很大的影响。

适合蜡状芽孢杆菌SFU-9菌株生长的最佳条件是:

培养基初始pH值为6.0~6.5，接种量5%(相对摇瓶装液量)，培养温度30~32℃，装液量28-33ml/250mL。

通过单因子分析和正交实验，确定出蜡状芽抱杆菌SFU-9的最优化培养基组成为：玉米淀粉2.0%，啤酒酵母1.5%，NaH2PO40.2%，Na2HPO40.2%，玉米浆2.0%。

(作者：不详)

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