牛蛙农场将杀蛙真菌的致命游动孢子，释放到自然环境中的影响

牛蛙养殖和贸易实践已经确立，分布全球，具有经济价值，但对生物多样性保护构成风险。牛蛙作为一种入侵物种对本地两栖动物种群产生负面影响外，在自然环境中传播杀蛙真菌Batrachochytrium dendrobatidis方面发挥着关键作用。

牛蛙对Bd有耐受性，这意味着它们可以携带高感染负荷而不会发展为壶菌病。为了测试牛蛙农场作为多种和毒性壶菌基因型的水库的潜力，我们量化了大约1，500只养殖牛蛙以及从农场释放到环境中的水中的Bd存在，患病率和感染负荷。

我们还描述了青蛙农场内的Bd基因型多样性，方法是从数十只受感染的蝌蚪中分离出Bd。我们观察到所有采样猪场中感染Bd的个体，具有高患病率和高感染负荷，养殖场平均流出水量高，Bd游动孢子浓度达到约50万个游动孢子/升。

由于在耐受宿主中生长时通常会选择毒力病原体菌株，所以我们进行了实验测试，所以与从本地宿主物种分离的基因型相比，从牛蛙中分离的Bd基因型在原生无尾宿主中是否更具毒性，我们对来自两个遗传谱系的36个Bd分离株进行了基因分型。

发现与从原生宿主分离的基因型相比，从牛蛙培养的Bd基因型在本地蟾蜍中表现出相似的毒力。我们的研究结果表明，牛蛙农场可以拥有较高的Bd基因型多样性和毒力，并可能导致毒力基因型在自然环境中的传播。

需要在牛蛙养殖场实施Bd监测和缓解策略，以帮助保护本地两栖动物，牛蛙原产于北美东部，并在亚洲、中美洲和南美洲大规模养殖，供应国际青蛙腿贸易，牛蛙养殖成为过度捕捞本地两栖动物物种的替代方案。

这种做法通过促进生物入侵，继续助长当前的全球两栖动物危机，牛蛙从农场逃跑导致入侵牛蛙种群的建立，通过干扰声学通信并危及本地无尾动物的繁殖而对当地无尾动物产生负面影响，捕食本地两栖动物物种并争夺资源，从而降低本地两栖动物种群的适应性。

牛蛙在两栖动物壶菌病的动态中也起着重要作用，壶菌病是一种由真菌Batrachochytrium dendrobatidis 引起的疾病，与全球两栖动物的下降有关。牛蛙是高度宽容的宿主，这意味着它们能够承受高 Bd 感染负荷而不会发展为壶菌病。

牛蛙是感受态病原体宿主和国际病原体载体，已发现交易牛蛙携带多种Bd遗传谱系，包括导致几大洲两栖动物减少的侵入性高毒力全球大流行谱系。

以及来自地方性动物谱系的基因型，由于与两栖动物宿主的长期共同进化，这些基因型的毒性往往较低，如BdASIA-2/BdBRAZIL报道的那样， BdCAPE， BdCH29和BdASIA-111。

牛蛙-Bd相互作用和牛蛙养殖实践的结合可能为壶菌病的爆发，和本地动物群的减少创造理想的条件，牛蛙的高Bd耐受性表明，农场可以作为特别致命的Bd基因型的宿主。

通过贸易引入的新型Bd基因型在原生宿主中也可能具有更高的毒力，而不是与它们共同进化的地方性基因型。除此之外，不同Bd谱系的易位可能使先前分离的Bd基因型接触，允许出现性杂交菌株，并可能产生比亲本谱系更具毒性的杂交种除此之外。

牛蛙养殖中使用的水通常未经处理就释放到自然环境中，可能携带可能感染本地两栖动物物种的活Bd游动孢子。牛蛙也以高密度养殖，为宿主之间的Bd传播，杂交发育和选择操作提供了理想的条件。

所以，牛蛙农场可能会促进致病性游动孢子持续溢出到本地无尾生物群落和繁殖毒力Bd基因型，但以前的研究尚未量化牛蛙农场的病原体流出或比较养殖和本地宿主物种在受控实验条件下携带的基因型的毒力。

牛蛙农场评估

在养殖蝌蚪中观察到的Bd患病率从5到48%不等。我们在所有猪场检测到Bd幼鱼，患病率达到100%，感染负荷高达71，029个动物孢子基因组当量，Bd患病率因两栖动物发育阶段而异，幼鱼的Bd患病率高于蝌蚪（Tukey P = 0.02），但成年蝌蚪则不然。

在考虑了误报误差的保守估计后，我们检测到了相同的模式，在考虑假阴性误差的保守估计时，Bd的患病率在整个生命阶段相似，青少年的感染负荷高于成人（t = 6.55，df = 1，P < 0.001）。

研究表明，入侵牛蛙种群的Bd患病率很高，并可能有助于Bd通过国际食品贸易在全球传播，我们缺乏关于青蛙养殖实践如何促进Bd传播到附近本地宿主社区的信息，以及牛蛙农场是否充当高毒性Bd菌株的储存库。

牛蛙农场不断向周围的自然环境释放大量的Bd游动孢子，青蛙围栏中Bd游动孢子的高浓度可能是由于受感染的青蛙围栏中的水运动造成的，牛蛙农场释放的Bd游动孢子不仅可以维持Bd在自然环境中的存在，还可以将病原体引入新的地点。

在养殖牛蛙中观察到的高患病率和感染负荷，可以通过这些农场中青蛙的高密度来解释，这通过个体之间的直接接触促进了病原体的传播或通过青蛙围栏循环，在理想情况下，动物的密度不应超过每升水 20 只蝌蚪。

或每米 100 只幼蝌蚪/50 只成年蝌蚪，我们在采样农场观察到所有青蛙，生命阶段的高牛蛙密度，圈养中的高宿主密度引起的应激，可能会降低宿主免疫能力并增加病原体载量。

牛蛙蝌蚪的Bd患病率低于青少年和成年人，养殖牛蛙蝌蚪中Bd的患病率接近或超过巴西大西洋森林和热带草原野生蝌蚪的患病率，我们采样农场所在的生物群系，虽然目视检查可以作为Bd诊断的代表。

在感染的早期阶段可能无法观察到口器去角化，我们在牛蛙农场检测到的患病率可能被低估了，当我们将误差估计应用于原始数据时，Bd患病率显着增加，使我们的发现更加糟糕。

上述方法使用不同的物种和环境条件，并考虑具有动物孢子基因组当量的个体Bd≥0.1，而本研究≥1 ，这可能会产生高估的假阴性值，但是，考虑到这些数据的合法性，牛蛙蝌蚪的患病率可能高于观察到的，所以我们最关心牛蛙农场的高患病率。

我们认为牛蛙养殖场的蝌蚪可能作为病原体的宿主发挥关键作用，保持水中高浓度的游动孢子，促进个体感染或再感染。

与蝌蚪相比，青少年的Bd患病率更高，与成年人相比，感染负荷更高。我们的研究结果证实了其他研究，显示成人感染负荷低与成人相比，患病率、感染负荷和死亡率更高的青少年，在过程中，蝌蚪经历了几个重塑免疫系统的生理过程，导致压力。

从而增加对Bd感染的易感性。除此之外，新的个体可能更容易受到Bd感染的影响，这是皮肤角质化发生的阶段，提供了新的底物并使它们成为角质造性病原体的极好宿主在野外，幼鱼的高患病率和感染负荷可能导致Bd的更大传播，因为这一发展阶段与高分散率有关。

Bd在所有农场和宿主生命阶段的存在表明，这种病原体有可能通过对牛蛙的商业生产产生负面影响来经济地干扰ranaculture。虽然该物种可耐受 Bd 感染，先前的研究表明，牛蛙蝌蚪对感染的反应表现出多种心脏改变。

可能会给发育中的动物带来高昂的能量成本，影响并可能降低生长和变质后的存活率。除此之外，蝌蚪的其他亚致死作用，如行为改变和进食减少，乳糜感染也可能降低青蛙的免疫反应，增加对其他感染的易感性。控制青蛙养殖场的壶菌感染可能会增加利润，因为生产的青蛙的生长和质量得到提高。

除了作为病原体的宿主外，牛蛙还可能拥有Bd的高遗传多样性。在我们的重点农场中存在两个Bd谱系，BdGPL和BdASIA-2 / BdBRAZIL，即使在同一个蝌蚪中，也创造了很高的杂交潜力。

杂交谱系，例如巴西大西洋森林中的BdGPL×BdASIA-2/BdBRAZIL之间的谱系，可能比亲本谱系更具毒性，根据混合活力理，Bd谱系的杂交在野外显然很少见，但青蛙农场可能会加剧新杂交种的风险。

由于Bd的生成时间短，预计牛蛙农场的毒力会发生变化，主机容差高，宿主种群密度高，我们发现与野生青蛙相比，没有发现来自牛蛙农场的分离株具有更高毒力的支持。

相反，当Bd感染负荷超过100，000个游动孢子时，B. ephippium的个体死亡，与分离株或来源无关。相比之下，10，000个游动孢子的感染负荷阈值被认为是水产繁殖物种的致命，表明这些阈值因生活史截然不同的物种而异。

我们在宿主个体之间观察到的Bd负荷的高度变化，可归因于可以单独或协同作用的多种因素，先天性和适应性宿主免疫应答的变化，基因表达，以前与病原体接触过和主机压力水平可能调节感染强度。除此之外，来自不同菌株的感染可能导致不同的Bd负荷。

我们的研究强调了牛蛙农场在Bd传播到本地宿主社区中可能发挥的突出作用。它表明，在牛蛙农场进化的Bd菌株，可能会通过将游动孢子释放到环境中来影响易感的本地物种。

结果表明，分布在世界各地的牛蛙养殖场为Bd，在养殖场内外的生存、繁殖和传播提供了潜在的环境，通过农业减少壶菌传播的一种可能方法是处理释放到环境中的水。

牛蛙也应使用先前报道的治疗方法治疗Bd感染，旨在治疗和控制两栖动物养殖系统中，Bd的其他研究将有利于本地两栖动物保护工作。

实验室感染实验

在实验室进行了实验接种，以测试不同Bd分离株对两栖动物宿主的影响。我们使用Brachycephalus ephippium作为实验宿主。短头颅菌是巴西大西洋森林特有的直接发育物种，直接显影剂在野外Bd患病率低，通常对壶菌病的抗性较低。

所以，它们是感染试验的理想模式生物。在巴西圣保罗州Mogi das Cruzes市收集了B. ephippium。我们单独将每只野生捕获的个体都装在带有落叶的塑料袋中，以避免青蛙在野外时潜在的交叉污染。

擦拭了所有个体青蛙，只使用那些在野外检测出Bd阴性的青蛙。在实验过程中，我们将每只青蛙，单独安置在装有高压灭菌潮湿泥炭藓的塑料盒中，每天监测青蛙，并喂它们钙强化针头蟋蟀。在温度受控的房间里进行了实验，温度设置为20°C，昼夜循环12小时。

我们将青蛙暴露于本研究农场采样的牛蛙中的三种Bd分离株，以及先前从本地两栖动物宿主分离和基因分型的三种Bd分离株，我们的实验设计包括七种处理，每次处理八只青蛙。

所有分离株都在BdGPL-2分支内28，这是巴西大西洋森林的主要形式，我们将Bd分离物在培养皿中用胰蛋白胨琼脂在17°C下培养五天。

然后，我们通过用蒸馏水淹没培养皿，并等待大约一个小时，从游动孢子囊中释放出游动孢子来收获Bd游动孢子，我们在Neubauer血细胞计数器中定量了游动孢子，并标准化了接种物浓度中的分离株。

结论

使用具有二项分布的一般线性模型来测试宿主发育阶段之间Bd患病率的差异;我们进行了Tukey HSD后验测试以进行多重比较，我们重复了这一分析，同时考虑到与目视检查方法相关的假阴性和假阳性的估计率。

运行具有正态分布的GLM，以测试宿主发育阶段之间Bd感染负荷的差异，我们对日志变换 感染负荷数据以获得具有正态分布残差的 GLM。

建立生存曲线来测试隔离源对个体宿主生存的影响。进行类似的分析，以测试分离株对宿主存活的影响，我们使用广义线性混合模型来测试暴露于，牛蛙Bd分离株的Bd感染负荷是否，高于暴露于本地青蛙分离株的Bd感染负荷。

包括作为随机效应的六种Bd分离株，对于这些分析，我们纳入了实验中途（第16天）收集的样本，并纳入了在第16天之前死亡的个体的拭子，从该分析中排除了对照组。

我们还进行了Tukey HSD后验检验，用于均值之间的成对多重比较，使用简单的方差分析来测试暴露于不同分离株的个体在死亡点的平均感染负荷的差异。

(文：云杉奇谈)

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