黄颡鱼“裂头病”细菌性病原的分离与鉴定

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黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）是我国主要淡水水域中分布比较广、具有比较高经济价值的小型鱼类，因其肉质细嫩、味道鲜美、肌间刺少，深受广大消费者的欢迎。近年来，在江苏、浙江、广东和四川省的部分地区，人工养殖黄颡鱼规模和集约化程度不断增加，部分养殖户也因养黄颡鱼成功而获得了比较好的经济效益。伴随黄颡鱼养殖规模的迅速扩大、集约化程度大幅度提高，各种疾病对黄颡鱼的危害也日趋严重，其中细菌性疾病就是对养殖黄颡鱼危害比较严重的一类疾病。国内报道的黄颡鱼细菌性疾病的病原主要有属于气单胞菌属（Aeromonas）的部分种类，如气单胞菌点状亚种（Aeromonas subsppunctata）等，可以引起黄颡鱼发生烂鳃、肠炎、打印病、出血性水肿等症状。

自2012年5月开始，我们对江苏省盐城和浙江省菱湖地区人工饲养过程中出现“裂头病”的黄颡鱼进行了致病菌的初步研究。从患病池塘中收集具有典型病症黄颡鱼，从腹水、肝脏、肾脏等处分离细菌，结果获得了在培养基上形态高度一致的菌落，用其人工感染健康黄颡鱼的结果证实了所分离的菌株即为引起黄颡鱼“裂头病”的病原菌。经过采用经典的生理生化指标测定及16SrDNA同源性及系统发育分析等结果，确定了引起黄颡鱼“裂头病”致病菌为鮰爱德华菌（Edwardsiella ictaluri）。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

具有“裂头病”典型症状的患病黄颡鱼（图1），于2008年5~10月采自江苏省盐城地区和浙江省菱湖地区的部分养殖场饲养黄颡鱼的池塘。这些患病黄颡鱼体长在3.0~13.0 cm之间；健康黄颡鱼取自江苏盐城大浩水产（盐城）有限公司大丰养殖场的黄颡鱼养殖池塘，体长约为（5.5±1.6）cm。

1.2 病原菌分离

取具有典型“裂头病”病症的黄颡鱼，用70.0%酒精进行体表消毒后，在无菌条件下按照无菌操作的方法，分别从其肝脏、肾脏、鳃、溃烂皮肤处及腹水等病灶处采样，划线接种于BHI（Difco）琼脂平板上，在36℃恒温培养箱中培养72 h后，挑取形态特征大致相同的优势菌落进行分离、纯化3次，转接于试管斜面培养基中，低温条件下保存。

1.3 人工攻毒

选择健康、活泼无外伤，平均体长为（6.3±0.6）㎝的黄颡鱼作试验鱼。在每个1.0m×1.0 m×0.5 m的塑料水族箱中饲养30尾黄颡鱼，每天投喂相当于鱼体重2.0％的人工配合饲料（盐城裕达饲料有限公司生产的黄颡鱼专用配合饲料）。驯养10d，待供试黄颡鱼适应环境，并确认无疾病症状后，开始试验。试验期间日均换饲养水量约50.0％，连续充氧并且及时清污。设置4组试验组及2个对照组，每组30尾黄颡鱼。利用从患病黄颡鱼体内分离并经过纯化培养的5个菌株，在BHI培养基中培养72 h后，用灭菌生理盐水洗下菌落、稀释成浓度为3.2×l07cfu/mL，作为攻毒菌液备用。

采用2种方法进行活菌攻毒，一种是注射法攻毒法。即直接对每尾黄颡鱼的胸鳍基部注射菌浓度为3.2×l07cfu/mL的活菌液0.1mL后，放入水族箱中继续饲养观察（图4）。每个菌株制备的菌液采用2个平行组作为注射法试验组，对另一组黄颡鱼注射相同剂量的灭菌生理盐水，作为注射法的对照组。

另一种是浸浴法攻毒，即首先向玻璃烧杯中添加适量的活菌液，使水中的菌浓度达到3.2×l05cfu/mL，再将以钢丝球划伤体表的黄颡鱼放置于玻璃烧杯中浸泡1.0h以上，以保证供试鱼体能充分接触到病原菌（图5）。浸泡后的黄颡鱼放回塑料水族箱中继续饲养、观察。

经过不同方法活菌攻毒后的黄颡鱼在饲养观察15d的过程中，记录其发病症状和死亡数量，取呈现与自然条件下相同的典型“裂头病”症状的黄颡鱼，从腹水、鳃、肝、溃烂皮肤处进行病原菌的再分离、鉴定。

1.4 生理生化指标测定

病原菌生理生化特征的测定及有关分类鉴定参考《一般细菌常用鉴定方法》（中国科学院北京微生物研究所细菌分类组，1978）和《伯杰细菌鉴定手册（第九版）》（布坎南和吉本斯，1994）。

1.5 16SrDNA序列同源性分析及系统发育树的构建

1.5.1 模板DNA的制备

挑取单菌落悬浮于50.0μL的去离子水中，100.0℃水浴加热5.0 min；4℃条件下，以12,000 r/min 的速度离心20 min，上清即作为模板DNA。

1.5.2 PCR扩增

利用细菌16SrDNA广谱引物，正向27F：5’ -AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG- 3’（对应于Escherichia coli 16SrDNA的8-27 bp位置），反向1492R：5’ -TACGG（C/T）TACCTT GTTACGACTT- 3’（对应于E．coli 16S rDNA的第1492-1510 bp位置）进行PCR扩增。PCR反应体系（100μL）含10.0 μL 10.0×PCR缓冲液（含Mg2 ），2.0μL l0.0 mmo/L 4×dNTP，各5.0μL10.0μmol/L正向和反向引物，1.0μL Taq DNA聚合酶（5U），10.0μL模板。PCR反应条件为：94℃变性4min；94℃ 平衡30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 40s，30个循环；72℃ 温育6min。PCR扩增产物由上海生工生物工程技术有限公司进行纯化和测序。

1.5.3 序列分析

将测得的菌株16SrDNA序列输入到GenBank数据库中进行Blast比对，并与从GenBank数据库中获得的相近序列一起，运用Clustalx1.8软件进行多重序列匹配排列，生成MEGA格式文件。使用MEGA 3.0软件，采用邻接法（Neighbour-joining）构建系统发育树。通过自展分析（Bootstrapping）进行系统发育树的置信度评估，自展数据集为1,000次。

1.5.4 核酸序列

用于构建系统发育树的相关菌株及其在GenBank核苷酸序列数据库中的序列存取号如表1所示。

2 结果

2.1 人工活菌攻毒后黄颡鱼的症状与死亡状态

黄颡鱼经过不同的方式人工感染分离的菌株以后，死亡的数量以及开始死亡的时间均有所不同，详细结果见表2。

由表2所示，从受感染的黄颡鱼死亡数量以及开始死亡的时间可以看出，分离菌株的毒力强弱是有所不同的。经过注射攻毒的黄颡鱼最早的死亡发生于注射菌株后的第48h，浸浴攻毒的死亡率相对比较低，而注射攻毒组死亡率比较高，试验组死亡率最高达到100.0%。试验鱼在临死之前呈现的症状与自然条件下的患病鱼相似，主要呈现出体表、头部充血。而对照组黄颡鱼活动正常，未出现死亡现象。从病鱼的鳃、肝脏、肾脏、腹水及溃烂皮肤等处再次分离到了感染菌，试验结果符合柯赫法则。

在试验条件下，出现疾病症状的病鱼摄食减少，游动迟缓，常独自游弋在水面或垂直悬浮于水面，有不停旋转的症状；体表（包括鳍、鳍基、头部、鳃盖、口部、下颌、腹面及其它体表部位）出现不同程度出血现象；腹部肿胀，积有腹水；肝脏充血或出血、或因失血呈色淡，后期伴有背部、头部出血、皮肤溃烂，死亡率也是非常高的。

2.2 致病菌的生理生化特性鉴定

从具有典型病症的黄颡鱼的腹水、肝脏、肾脏、鳃、溃烂皮肤等处均分离到占优势的菌株，菌落形态、大小、颜色在BHI琼脂平板上均一致：菌落圆形、边缘整齐、灰白色、湿润。对其中该5个菌株进行进行的生理生化特性分析结果如表3。

由表3所示结果可以看出革兰氏染色、鞭毛染色等光镜观察、生理生化指标测定结果显示，氧化酶阴性、精氨酸双水解酶阴性、尿素酶阴性、H2S产生阳性、吲哚产生阳性、乳糖水解阴性、蔗糖水解阴性、鼠李糖水解阴性、接触酶阳性、赖氨酸脱羧酶阴性、枸椽酸盐阴性、明胶水解阴性、鸟氨酸脱羧酶阳性、过氧化氢酶阴性、V.P实验阴性、甲基红试验阳性、丙二酸利用阴性、七叶苷水解阴性、L-阿拉伯糖水解阴性、D-甘露糖利用阳性、山梨醇水解阴性、麦芽糖水解阳性和葡萄糖发酵产酸、产气；进行16S rDNA序列分析后发现它们各项指标均一致，故取其中1株HSY-12-02（从肾脏中分离纯化获得）为代表菌株，进行后续实验。

2.3 16S rDNA序列系统发育分析

从患病黄颡鱼肾脏中分离获得HSY-12-02菌株与作为对照的鮰爱德华菌（中国微生物菌种中心）PCR结果（图6）。GenBank中同源序列检索结果显示，HSY-12-02与鮰爱德华菌属细菌的l6S rDNA序列自然聚类，与实验菌相似度最高的10多个结果同属Edwardsiella属，其中与鮰爱德华菌的同源性最高，达99.0％。在检索结果中选取9个参比菌株，从Genbank中下载其l6S rDNA序列，构建系统发育树；系统发育树中同一个种的2个标准菌株亲缘关系最近并聚为1个分支，在中实验菌株与鮰爱德华菌自然聚为一支，表明它们亲缘关系最近，因此，我们将其初步鉴定为鮰爱德华菌（Edwardsiella ictaluri）。

3 讨论

对引起鱼类疾病的致病菌分离后鉴定的方法主要有3种，即传统的生理生化指标测定法，由自动鉴定系统鉴定的方法和运用分子生物学手段进行鉴定的方法（郭明元等，2006）。这些方法各有其特点和不足，传统的生理生化实验因为操作过程比较繁琐、耗时长且受主观因素影响比较大；16SrDNA系统发育树分析通过比较细菌核糖体RNA基因片段的同源性实现对细菌的分类学鉴定，可靠性比较强，但是，到目前为止尚有多种细菌的完整16SrDNA序列尚未被测定，因此，给新鉴定细菌的结果准确性也可能带来一定的影响，最好还需要有生化特性鉴定结果作为其佐证（范文辉等，2005）。本研究中在采用生理生化指标测定其菌株特性的基础上，还运用分子生物学手段进行了鉴定，两种方法互相验证，所获得的结果应该是比较准确的。

根据已经有的研究结果，鮰爱德华菌具有比较特殊的寄生状态，即当进入鱼体的鮰爱德华菌被吞噬细胞吞噬后，不会被细胞杀死，而是可以随吞噬细胞而被带入肝脏和肾脏的类血窦，还可以在吞噬细胞内增殖，从而破坏这些吞噬细胞。扩散出来的鮰爱德华菌又可感染类血窦周围的内皮细胞，并且在此形成一个微小的病灶，随后逐渐扩大（Wakabayashi and Egusa，1972；Wakabayashi and Egusa，1973）。鮰爱德华菌对鱼类的感染范围也是很广的，与其它发生爱德华菌病的鱼类相比，黄颡鱼发生鮰爱德华菌病以后，最为典型的特有症状是头部发红（这个症状与患病的斑点叉尾鮰有相似之处），腹部膨大并积有大量血红色腹水，同时体表出现出血点或者血斑。

此外，爱德华菌可以感染蛇、蜥蜴、龟、鳄等变温动物及鸟类、臭鼬、猪、马、家兔等恒温动物，有人认为爱德华菌是蛇类正常肠道菌群的成员之一（Sakazaki，1965）。

（作者：陈福昌、宋刚杰、孙立威、吴强强、何登平、张加林 华中农业大学水产学院、苏州通威特种饲料有限公司）

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