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淡水鱼病毒性疾病的研究进展

发表时间:2017/11/14  作者:吕文雪 孟庆峰 钱爱东 王伟利  
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 0  引言
    在中国,淡水鱼是水产养殖的主要鱼类之一,不但是主要食用鱼类之一,而且许多品种还是供观赏的,比如色彩艳丽的锦鲤。淡水鱼类会受到各种致死性疾病的侵袭,致死性疾病包括病毒性疾病、细菌性疾病和寄生虫疾病。病毒病原微小,感染动物后便在宿主细胞内复制,抗菌素对病毒几乎不起作用,而化学药物在灭活病毒前就可能对宿主细胞产生损害。尤其在每年的春秋季节,是鱼类病毒性疾病的多发季节,因为水温是最适合病原生长繁殖的。同时,病毒性疾病具有潜伏期长短不一,发病症状复杂多变,传染性强,死亡率高的特点。1998年在美国和以色列暴发的大规模鲤鱼死亡,经实验室剖检和分子生物学诊断,确定这些鲤鱼是感染锦鲤疱疹病毒引起的。在20世纪80-90年代期间,中国曾经报道过鱼类传染性胰腺坏死病的暴发,引起鲑科鱼类的大量死亡,给鲑科鱼类的养殖业造成严重的经济损失。因此,增强鱼类病毒病的认识,了解鱼类病毒病的最新研究情况,为深入开展科研工作提供理论基础和科学依据。
1  流行情况
    随着近几十年水产业在全世界的快速发展。有关淡水鱼病毒性疾病的报道开始出现,早在1967年发现的一种虹鳟鱼病毒病—传染性造血器官坏死症,当时是沿着太平洋沿岸流行传播的,随着国际贸易交往的增多,美国、日本等国家也先后暴发了此病,也造成了巨大的损失。其他的淡水鱼病毒性疾病也在随后的几十年有过报道,传染性胰腺坏死病和病毒性出血性败血症也是发现较早的病毒性疾病,先后在国外得到确诊,并于不久后传播进入中国境内,即1984-1989年,在中国检测并诊断到传染性胰腺坏死病。病毒性出血性败血症也在这段时间传播进入中国,在中国的局部地区暴发流行,在1995年,此病主要在北美洲和欧洲的一些国家暴发流行,给当时的国际水产贸易带来了重大的影响。流行范围比较广泛的鲤春病毒血症病毒最初是由Fijian等分离得到的,此病最初只是在欧洲的大部分地区流行,后来陆续在巴西、美国、加拿大、中国报道过,在中国还没有大范围的暴发流行过,它给世界养鱼业和渔业市场带来的经济损失是不可估量的,SVC已被OIE列为必须申报的疾病,中国农业部也将之列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》中的二类动物疫病。
    下面介绍一种影响更大的淡水鱼病毒性疾病的流行情况锦鲤疱疹病毒病。此病自从以色列和德国报道第一例以来,KHV的分布范围变得越来越广泛,从相关的报道和出版的文献来看,KHVD最少覆盖了包括中国在内的22个不同的国家,欧洲的奥地利、比利时、丹麦、法国、意大利、卢森堡、荷兰、波兰、瑞士和英国。亚洲的一些国家:中国(香港)、中国台北、印度尼西亚、日本、马来西等国家。此外,美国也报道了KHV疾病的发生。事实上KHV疾病流行的国家可能要更多,只是暂时还没有报道或尚未确定。此病的死亡率高达80%~100%,死亡较快,一旦暴发流行,将给鱼类养殖业造成巨大的损失。
2  国内外研究进展
    随着世界各国渔业养殖的规模化和国际贸易交流的增加,国内外对淡水鱼的病毒性疾病的研究也在逐渐增多。国外科学家对病毒性疾病的研究起步较早,中国对病毒病的研究还处在起步阶段,病毒的一些生物学特性、基因序列的分析和蛋白的功能方面的工作还尚未开展。
    以锦鲤疱疹病毒病为例。之前各个国家对它的认识还很局限,尤其是以水产业作为国家支柱产业的国家,此病的死亡率高、传播速度快、发病时间短、暴发范围广等特点,给这些国家的渔业养殖带来了无法弥补的经济损失,让养殖者、锦鲤爱好者和鱼类零售商重新审视了锦鲤疱疹病毒病,并加强了对此病的监控与管理,随后在东京的河水中检测到了KHV,此病在野外的暴发给监管部门的管理带来了更大的阻力和障碍,再次敲响了警钟。锦鲤疱疹病毒的致病机制还在研究的初级阶段,有研究人员提出过这样一种假设:遭受锦鲤疱疹病毒粒子感染的鲤鱼或锦鲤,它们污染过的水里可能存在的病毒粒子可以通过鳃进入鱼体内,病毒粒子在鱼体内进行大量复制,同时导致表皮黏膜腐败和坏死。然后病毒粒子快速的从鳃传播到肾,诱导间质性肾炎,最终诱导健康鱼发病;另一种说法是病毒通过表皮脱落或腐败的方式释放到水中,在经过鳃侵入鱼体内进行复制,再把病毒粒子释放到水中,以此重复循环感染鱼体。Costes等学者也证实了病毒粒子主要是通过皮肤感染进入鱼体内的。   
    目前,其他几种病毒病的致病机制已经很清楚了,传染性胰腺坏死病和病毒性出血性败血症等疾病已经得到了有效的控制,国际动物卫生组织已经公布了标准检测方法,供各检验检疫部门参考使用。   
3  病原学研究   
    目前,大多数淡水鱼病毒病的病原都是确认的,基因组的大小及病毒的结构特征基本得到了统一。但也有个别例外,锦鲤疱疹病毒是否属于疱疹病毒还存在争议,Pikarsky等研究得出结论,KHV基因组大小明显大于疱疹病毒基因组的大小,不应属于疱疹病毒科,更确切的命名应为鲤鱼肾炎鳃坏死病毒,也有人提出了相反的意见,Waltaek等也证明了该病毒分类属于疱疹病毒,并且在命名了其他两种鲤科病毒后将其命名为鲤科病毒3(CyHV-3)。Aoki等也描述了KHV的基因组序列全长295k bp,包括长22k bp的末端重复序列,在疱疹病毒科里,此病毒基因组是最大的。并且鉴定了156个特异编码蛋白的基因,认为KHV全基因组的15个基因与IcHV-1基因有同源性,也为KHV属于疱疹病毒科提供了充分有力的证据。   
4  病毒病的检测与诊断   
4.l  病原的分离鉴定—细胞培养   
    利用不同的敏感宿主细胞系分离和纯化病毒,后利用病毒中和试验(NT)、免疫荧光试验(IF)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)等方法中的一种确诊。这是一种传统的、可靠的检测方法,但此方法受诸多因素的限制,一是淡水鱼细胞生长周期较长,对温度有苛刻的要求,一般20℃左右是鱼细胞生长的最适温度;二是有些鱼的敏感宿主细胞较难制备或没有商品化的细胞系出售,比如锦鲤疱疹病毒的最适生长细胞系,是鲤鱼鳍条细胞系(KF-1)和鲤鱼脑细胞系(CCB),很难制备出高质量的敏感细胞系;三是培养鱼细胞系所需费用较高,不适合科研经费很紧张的科研院校和研究所使用。所以利用细胞分离鉴定病毒不适和推广到基层,而且此方法的敏感性也不如PCR方法。
4.2  血清学实验
    血清学检测技术包括中和实验、酶联免疫吸附试验、对流免疫电泳、琼脂扩散实验、荧光抗体技术等技术。中和试验是检测鱼类病毒病的经典检测方法,目前已广泛应用于IPNV、SVCV、IHNV等病毒的常规检测中。荧光抗体技术已经在IPNV、SVCV、IHNV等病毒性疾病的诊断中应用,国外有科学家应用此技术检测KHV的存在与否。ELISA技术也成功应用到IPNV、SVCV、IHNV、KHV的实验室诊断中,此方法对抗体要求较高,需要的单克隆抗体要经过纯化,且抗体效价要求较高,因为有些病毒易产生非特异性抗体,易与其他的鱼类病毒产生交叉反应,影响诊断的可靠性。所以,这也限制了ELISA技术在临床诊断的推广应用。
    总体来看,制备高效价的单克隆抗体是ELISA技术成功的关键因素,单克隆抗体可以更准确、有效地进行诊断,避免非特异抗体的干扰。目前中国已经成功制备出鲤春血症病毒的单克隆抗体,还未见到有成品销售,其他鱼类病毒病的单克隆抗体市场上销售的也不多见。
4.3  分子生物学方法
    利用分子生物学的方法检测病毒粒子的存在是一种新的研究趋势,也在逐渐发展壮大起来。应用较多的分子生物学的检测与诊断方法包括PCR检测技术、荧光定量PCR检测技术,巢氏PCR检测技术等。而PCR检测技术是应用最多的检测技术,因为此方法有特异性高,敏感性高,检测结果可信度高,省时省力是实验室检测与诊断的最优选择。
    目前,国家公布的检测锦鲤疱疹病毒的标准就是PCR检测技术,这种方法是从病鱼的新鲜组织器官样品中检测KHV DNA最为敏感的检测方法。该规程同样适用于检测具有亚临床症状的病毒。最早应用TK探针发展该规程的是以色列希伯来大学的Bercovier等,而后是日本水产养殖自然研究所(NRIA)的Yuasa等人,并且经过了Gray等的改良后发表。若是组织样品有腐烂迹象,则应用探针位点靶向基因组的稍短区域,正如Hutoran等所研究的那样。或者应用已公开发表的引物来对KHV基因组中更短的靶序列进行扩增。段宏安等应用PCR检测技术成功的从有临床症状的锦鲤中检测到KHV,孟庆峰等也利用PCR方法检测到了锦鲤疱疹病毒的TK、Sph、ORF7 3个主要靶基因。鲤春病毒血症病毒的检测与诊断应用到荧光RT-PCR和PCR,但还没有包括到OIE已公布的标准检测方法中。病毒性出血性败血症病毒及传染性胰腺坏死病毒等病毒的检测也都有PCR、逆转录PCR、荧光探针等检测方法的应用。
4.4  LAMP(loop-mediated isothermal amplificatiOn,环介导等温扩增技术)
    LAMP是一种快速的诊断病毒或细菌核酸的新技术。在等温条件下,LAMP反应能快速的扩增核酸,具有高特异性和有效性等特点。到现在为止,Lamp技术在鱼病毒的检测中,应用的还比较少,在KHV的检测中已经应用了LAMP检测方法,Mansour应用lamp技术在短时间内就可以检测发病样本,而且在加入荧光染料的反应体系内,肉眼就可以看到颜色的变化,大大缩短了检测时间。也有应用RT-LAMP检测传染性胰腺坏死的,其检测病毒核酸的最低量达到0.001fg,检测时间缩短到1h,但是这种方法还没有推广使用。
5  疾病的防治
5.1  疾病的预防
5.1.1  疫苗的制备一般来说,活疫苗对机体的免疫系统一直都有免疫刺激作用,能够诱导体液免疫和细胞免疫同时发生,刺激发生局部反应和全身性的均衡,而活的弱毒疫苗对免疫鱼的效果特别显著。以色列的科学家通过KF细胞的传代,获得非致病或致病力很弱(不会导致接种锦鲤死亡)的锦鲤疱疹病毒弱毒毒株,将此弱毒接种健康锦鲤,可以有效的保护免疫锦鲤不受病毒的攻击。由此可以看出,弱毒疫苗的生产对于水产业的发展具有很大的影响。然而在其他的几种淡水鱼病毒病中,疫苗的制备还处在经典方法的应用阶段,还有大量的研究工作有待开展。最近几年相继面世的基因工程疫苗,核酸疫苗已经在人类病毒病防治中得到应用,这为水生动物病毒病的免疫治疗提供了借鉴,同时活的弱毒疫苗的研究是未来发展的方向。
5.1.2  预防措施
    (1)严格执行捡验检疫制度。对于可疑的鱼苗坚决不引进;(2)在鱼苗入池后,尽快调节池水温度。锦鲤疱疹病毒在23~28℃是最易发病的温度,水温保持在18℃左右可以减少发病几率,也不会对鱼的生长造成影响;(3)在流行过此病的地区改养对该病不敏感的鱼类,而且放养前要对水池彻底清理,入池前的鱼苗要经过严格的筛选和消毒;(4)使用的工具及运输车辆要定期消毒;(5)饵料中要富含鱼苗生长所需的各种营养成分,以提高鱼体的免疫力;(6)合理的换水增氧,尤其在阴雨天或是冬季,保持鱼塘内有充足、新鲜的氧气;(7)养殖密度不宜太大;(8)加强日常管理,做到每天都观察鱼体活动情况,并做好记录;(9)发现疑似病鱼要尽快隔离,立即上报,并送相关部门确诊。
5.2  疾病的治疗
    (1)治疗方案。开启增氧机,减少投喂量,提高鱼体免疫力。可以使用“碧水爽”、“净水宝”、“优碘”等进行泼洒消毒,有较好的治疗效果,用量要根据发病的实际情况而定;(2)消毒。对于养殖人员、车辆及使用的工具要进行严格管理,并做好消毒工作,防止病原的扩散。
6  小结
    占人有这样一句话“防大于治”,它对于淡水鱼病毒性疾病也同样适用,所以淡水鱼病毒性疾病的预防显得尤为重要,要怎么预防成了关键因素。对于病毒病目前还没有特效预防药。而专家们也一致反对滥用药物,认为那样不仅会降低鱼等水生动物的肉质质量,并留下残留的毒性,还会降低动物自身的抗病能力,污染水体环境。所以制备高效价的疫苗是预防淡水鱼病毒性疾病的有效措施。从疫苗的研究情况看,灭活疫苗、减毒疫苗、细胞工程疫苗等对草鱼出血病的防治已做出重要贡献,对于其他水生动物,疫苗的制备与使用还处于不成熟阶段,还有大量工作有待展开。像锦鲤疱疹病毒到目前为止,国内只有组织灭活疫苗的研究,效果还不是十分理想,该病的较有效的疫苗是通过变温的方法或在敏感细胞上连续传代获得非致病的突变株,作为弱毒疫苗免疫锦鲤和鲤鱼,免疫保护率可达80%以上。但是弱毒疫苗存在易返祖和不易保存等缺点,还需要研究更加安全有效的基因工程疫苗,如DNA疫苗、基因工程亚单位疫苗、载体表达口服疫苗、转基因植物疫苗等,是未来鱼类疫苗研究的发展方向。
    淡水鱼病毒性疾病药物治疗应用的较少,进展缓慢,无高效的药物,一般的研究都停留在鱼体外细胞的抗病毒水平上,实际应用到体内的治疗水平还不够,一般的抗病毒药物对鱼类存在一定的毒性作用,研制无毒害的防治药物是今后发展的方向。
    锦鲤疱疹病毒病、传染性胰胜坏死病毒病、传染性造血器官坏死症及病毒性出血性败血症的致病机制还不是很清楚,国内对此病的研究还停留在初步阶段,部分鱼类病毒的基因组结构已经阐明,其基因编码蛋白的方式、基因表达的调控等有待进一步研究,并应用到定向抗病毒育种、抗病毒药物筛选等技术上。

    作者单位:(1.吉林农业大学动物科技学院,长春 130118;2.吉林出入境检验检疫局,长春 130062)

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