论文：锦鲤疱疹病毒研究进展

锦鲤疱疹病毒研究进展

李潇轩，朱天，杨志强，尹陆乐，李志辉，陈建清，韩飞

（江苏省淡水水产研究所，南京 210017）

锦鲤疱疹病毒病（KoiHerpesvirusDiease，KHVD），为疱疹病原科，鲤疱疹病毒属，是由锦鲤疱疹病毒（Koi 540Herpesvirus,KHV）所诱发的一种致死率高达80～100%的流行性疾病。主要感染鲤鱼，如锦鲤以及其他变异鲤科鱼类。首次发现于1998年，由德国和以色列学者从患病的鲤鱼和锦鲤中分离，并被得到证实的一种病毒。国内2001年于香港发生首例疱疹病毒爆发事件，随后在东南亚许多国家的也先后发生过疱疹病毒感染的事例。世界动物卫生组织（OIE）在2006年将KHVD列为强制性疾病。该文综述了国内外学者对于疱疹病毒最新发现与研究，以期为后续锦鲤疱疹病毒的研究以及实验设计提供理论依据。

1 流行病学特征和临床表现

1.1 国内外流行现状

1998年首次于德国和以色列发现锦鲤疱疹病毒，该疾病引起了大面积的锦鲤和鲤鱼死亡事件。我国境内第一例带状疱疹病毒感染事件发生于2001年的香港。该病在中国广东省于2002年首次被发现[4]。目前这种疾病已在30多个国家爆发，尤其是锦鲤养殖大国日本和对锦鲤爱好众多的中国广东境内，KHV爆发事件每年都会出现，但分布零星，在国内很少成片爆发，是一种全球性的高致死率的鲤鱼传染病。

1.2 流行病学特征

KHVD作为一种流行病症，感染面十分狭窄，目前并未发现有除鲤鱼、锦鲤和其他鲤鱼变异种外有患染这种疾病的鱼类。且在有报导的疱疹病毒暴发事件中发现，锦鲤池塘相比普通鲤鱼池塘更易感染和爆发疱疹病毒。疱疹病毒潜伏期约为7～15 d，其发病特点是当水温由冬入春或由夏入秋，当水温上升/下降到15～25℃的范围时，会突然爆发并迅速扩散，KHVD发病的最佳温度在18～25℃这个温度区间，当水温达到30℃以上时发病几率变小，KHV在鱼体中处于一个潜伏的状态。研究发现，KHV已经具备能够在平均温度为3℃的冰下繁殖能力[7]。KHV传染性极强，且传染方式较多，且在水中就能够传播，通过鱼体排泄出的尿液、粪便和体液均可迅速传播，且感染率极高，潜伏期7～15 d，一旦发病，死亡率高达80%～100%，当前从国外引进锦鲤需通过质检中心检疫病毒，一旦发现病例，采取联合当地渔政部门组织进行该批次鲤鱼、锦鲤的全塘灭杀的措施。

1.3 临床表现

锦鲤疱疹病毒主要集中爆发于春季锦鲤产卵前，3—5月，鲤鱼越冬后水温急剧上升至15～25℃的这段时期。发病前期锦鲤摄食量正常或者有所增加，发病期仍能摄食，在民间养殖户称“该吃的吃，该死的死”。锦鲤在感染KHV病毒后病发症状可分为三个时期，各个时期症状具有一定差异。病毒感染初期病鱼浮于水面不动或游动缓慢，部分病鱼体表发黑，鳞片脱落，皮下和肌肉出血，肛门略微红肿；鳍条、尾鳍充血，生病的鱼丝呈暗红色，减去一个完整的痰液，血流量比正常鱼慢，而且容易结痂；肠道红色，硬而且相当充盈，肾脏肿胀，胆汁颜色较深，颜色为红色，脾脏有多个出血点。病毒感染中期鱼体游动缓慢，与进入麻醉状态的鱼体表现相似，鱼体体色暗淡，呈灰白色，中后期表现出花斑，特别是德国鲤之类的无鳞锦鲤在水中病症尤为明显，鳞片鱼没有显示明显，并且帽子和丝绸流血并产生大量粘液。病毒感染后期，打捞出水面后病鱼鱼体体色发黑，双眼严重凹陷，腮部肿胀发紫红色，极易出血。通常患有KHV病毒的病鱼在1～2 d内死亡，病毒感染率高，病死率高。且易发生在体态肥硕的锦鲤身上，对观赏鱼锦鲤行业具有严重的打击性。

2 锦鲤疱疹病毒病原体

2.1 KHV的分类和命名

KHV为疱疹病毒科、鲤疱疹病毒属、鲤疱疹病毒3型。经过结合疱疹病毒发病症状，最终被命名为锦鲤疱疹病毒（KHV）。KHV形态结构类似于两种不同鱼类的疱疹病毒，但它在临床表现，生长特征，细胞变异类型，感染范围和抗原性方面不同[8]。

2.2 KHV分子生物学特性

KHV为直径100～110 nm的二十面体，是一种较大的线性、双链DNA病毒。属疱疹病毒目（Herpesvirales）、鱼类疱疹病毒科（Alloherpesviri－dae）[4]，病毒表面具有螺旋结构，在细胞核中具有不对称的电子致密区域。基因组大小为295 kb，内含156个开放阅读框（ORF）、末端8个重复序列。末端含22个正向重复序列，GC含量占总核苷酸的59.2%。病毒粒子成熟后呈球形，直径在170～230 nm之间。核衣壳呈二十面体的球状，直径约110 nm。结构对称，并且被囊状结构包围。水温达到15～25℃时，KHV可以存活将近4 h，并且在鱼体的分泌物和塘底淤泥中能够存活更多的时间。水温和盐碱度是影响病毒的重要因素之一，在60℃的温度条件下持续30 min或pH小于3或高于11的条件下，病毒将会失去感染能力。使用氯仿、250 mg/L的乙醚或1 mg/L TritonX-100可完成对细菌的灭活。

2.3 关于KHV基因组结构的研究

KHV的主要基因型已被鉴定出，但全基因组结构尚未确定，且对于编码蛋白的功能尚未有明确的研究成果。已经成功克隆出个别较保守且确定功能的ORF。

2.3.1 结构蛋白 2010年，MichelB等人构建出了KHV的蛋白结构。KHV的蛋白结构由：核衣壳蛋白（ORF72、ORF78、ORF92）、囊膜蛋白（ORF25、ORF32、ORF59、ORF65、ORF81、ORF99、ORF108、ORF115、ORF131、ORF132、ORF136、ORF148、ORF149）、间质蛋白（ORF62、ORF132）和22个未分类蛋白[5]组成。但其功能还未能够被全部验证。构建KHV的主要结构蛋白[7]是细胞质中存在ORF25的表达蛋白。

2.3.2 非结构蛋白 非结构蛋白是由病毒基因组编码，参与病毒的复制和基因表达调控，但与病毒颗粒互不相容的蛋白质。根据蛋白质功能的不同，将KHV的非蛋白结构分类为：ORF2家族、TNFR家族（肿瘤坏死因子受体）、ORF22家族、ORF25家族和Ring家族。ORF2 家族包含：ORF2、ORF9[9]。TNFR 家族包含：ORF4、ORF12。TNFR家族包含两个基因（ORF4/12）编码具有TNFR基序的蛋白质。6个膜蛋白：ORF25、ORF26、ORF27、ORF65[7]，ORF148 和 ORF149；RING家族共具有四个蛋白（ORF41、ORF128、ORF144、ORF150）的编码，均含有锌指结构（RING Finger）特征基序。dTTP是组成DNA分子的基本成分，TK基因的功能是将脱氧胸苷核苷酸催化成dTMP，然后将其磷酸化成dTTP，间接参与合成dCTP、dGTP和dATP等物质的过程。该基因决定了KHV的潜伏状态，以及在一定条件诱导下的爆发，所以学者们普遍认同的观点是KHV毒力来源于TK基因，对应胸苷激酶ORF55。ORF150为RING家族脂蛋白，ORF56为糖蛋白，膜蛋白ORF22，主要衣壳蛋白ORF92，ORF23 编码白介素-10。

2.4 传播途径

目前在感染KHV的病鱼排泄物和体液中均检测到了KHV的病毒DNA，所以大多数学者认为KHV在水中传播，且冬日水温降低之后病毒潜伏在粪便之中，春季水温升高时开始集中爆发并传染，这也是春季疱疹病盛行的因素之一。但在锦鲤疱疹病毒爆发规模较大的日本，学者们认为疱疹病毒的传播途径主要是通过鱼类的尿液，尿液携带病毒进入共同水域从而感染其他鱼体。

3 疱疹病毒的检测方法

由于KHV具有潜伏期长、传染率高和易感染等特点，且由于缺乏对疱疹病毒有效的治疗方案以及传染的预防措施，所以在国内养殖场或从国外进口锦鲤的检疫隔离期间，一旦发现KHV的存在立即执行全塘/池灭杀。随着日本福冈县与江苏省建交25周年，日方赠予江苏省220条日本锦鲤，全国规模最大设施最豪华的检验检疫隔离场坐落南京，打开了一扇新的锦鲤进出口窗口，再加上近年“锦鲤”一词在网络上的爆红，进口锦鲤与养殖锦鲤的玩家越来越多，所以为了降低锦鲤养殖的风险以及爱好者的损失，该行业迫切的需要一种能够及时发现病毒，并且耗费成本较低的检测方法，以降低KHV带来的经济损失。到目前为止，通过不断的研究和实验，研究出了许多锦鲤疱疹病毒的检测方法：细胞分离培养试验，血清中和试验和分子生物学试验[22]。

3.1 细胞分离培养技术

3.1.1 环介导等温扩增（LAMP） 通过不断研究和改进，使用环介导等温扩增（LAMP）法测定锦鲤疱疹病毒的特异性和敏感度越来越高。Wen-HSin等建立了一个在集成微流体系，运用LAMP方法分离病原[27]，仅使用90 min，便可完成对4种病原的检测，而PCR技术需要较长的检测时间才能得出准确结果，LAMP也能得出相对准确的结果。因此,随着科学研究的发展，LAMP极有可能成为快速检测KHV的主流方法。

3.1.2 分子生物学诊断方法（PCR） PCR技术是当前被广泛用于检测KHV的方法，检测方法相对具体和敏感，可以取鱼体鳃部样本进行初级检测，但是要进行完整检测需取6处不同的样本，但此方法涉及鱼体的肾、脏，所以仅适用于死鱼检测。在国外私营性质的工作室会采用PCR技术进行取腮样本的初步试验，来降低出口锦鲤携带KHV的可能性，但不进行完整检测仍然无法规避这一风险。

3.1.3 其他检测方法 除了上述两种常见的检测KHV的方法外，国内还有ELISA、电子显微镜技术和原位杂交技术等检测方法。但是ELISA法花费较大，而且与CCV和CHV会发生交叉免疫反应，因此有学者认为它不适合日常检测和推广。电子显微技术和原位杂交技术所需要的设备费用十分昂贵，更不利于日常检测和推广。

4 锦鲤疱疹病毒防控措施

KHVD具有高传染性和高感染性的特征，一旦爆发将带给鲤鱼、锦鲤养殖户及锦鲤爱好者巨大的经济损失，及时检测和进行防控有助于降低这一损失。

4.1 免疫预防

目前防制KHV的最有效方法是使用疫苗免疫，减毒疫苗已经由开发商投入并在一些规模较大的渔场投入使用。减毒疫苗对鱼的免疫保护的效应期可达8个月以上，但目前在对行业中已经开始投入使用的研究中发现，并不能够对该病情的控制和病毒免疫产生理想的效果。目前，该疫苗证明对疱疹病毒的的有效处理方式是配合疫苗通过变温或在细胞上连续传代获得突变株，效应期间，通过试验减毒疫苗免疫的锦鲤和鲤鱼免疫保护率在理论上可达到80%以上。减毒疫苗可以有效地刺激鱼的细胞免疫功能，并且延长细胞的免疫时间，具有广泛的特异性，但是减毒疫苗可能会发生病毒变异和毒散，造成一定的负面影响。

4.2 其他防治措施

部分研究[27]相信，KHVD的流行性根本原因在于水温的季节性变化，并认为控制水温即可控制病毒爆发。但是最新研究发现即便在冰下，KHV仍然能够繁殖，所以控制温度并不能在根本上解决病毒爆发的问题。部分锦鲤研究者想通过筛选具有抗病性的锦鲤家系来减少锦鲤疱疹病毒带来的危害，但是目前筛选效果不理想且并未出现对于锦鲤疱疹病毒产生抗体的锦鲤品系。

5 锦鲤疱疹病毒的发展前景

KHVD自发现以来对锦鲤行业产生了巨大的影响，国内目前还没研究出能够防治KHVD的有效措施，且缺乏有效的防控手段，所以一旦检测发现携带锦鲤疱疹病毒的病鱼需立即执行同一水域的全塘灭杀，这种直接的处理方式对锦鲤爱好者及鲤鱼、锦鲤养殖户会带来十分惨重的损失。随着观赏鱼行业的开拓和锦鲤受众者的增多，防治疱疹病毒研究的步伐也在不断加快。KHV从出现到开始在全球呈流行性爆发已经持续了二十多年之久，但由于其宿主范围十分狭窄且病毒结构十分复杂，国内对于疱疹病毒的研究仍旧比较稀缺。在锦鲤养殖规模最大的日本，许多学者认为疱疹病毒的爆发并非是一种自发性的爆发，而是受水温以及环境因素的诱导而形成爆发的一种病毒；而且在病毒出现长达的20年间，并未有能够产生抗体的锦鲤家系出现，所以通过筛选优良家系来对抗KHV的显得十分困难，且针对疱疹病毒的疫苗虽然能够在理论上达到防治KHV的效果，但在实际使用中的效果并不理想。

近年锦鲤已经重新获得了进出口的允许，为规避从外来的鲤科鱼类、特别是锦鲤体内携带疱疹病毒进入内地的可能性，中国海关要求进口锦鲤需要在隔离场内进行为期一个月的隔离，并在当地质检中心对进境锦鲤进行两次的抽样调查检测，保证对外来病毒的入侵的严格把控。但国内还存在不少携带锦鲤疱疹病毒的病鱼，如何有效地治疗已经感染的病鱼及防止与其共用同一水体健康鱼体感染疱疹病毒显得尤为重要，研究开发真正能够用于生产上的基因疫苗，防止病毒扩散，并控制KHV的全球性暴发，从而减少养殖户和观赏鱼玩家的经济损失，确保锦鲤和鲤鱼养殖业乃至休闲渔业的健康发展。