罗非鱼湖病毒微滴式逆转录数字PCR检测方法

罗非鱼湖病毒（Tilapia Lake Virus disease, TiLVD）可以感染罗非鱼的各个生长阶段，且发病快、死亡率高，目前尚无针对性的疫苗。近日，东莞市动物疫病预防控制中心张险朋团队研究建立了一种敏感性高、特异性强、重复性好的罗非鱼湖病毒微滴式逆转录数字PCR（RT-ddPCR）检测方法，为国内外的首次报道。该方法最低检测病毒分子数为2 拷贝/μL，敏感性高于目前国内外已建立的其他分子生物学检测方法，可为罗非鱼湖病毒的定量检测和标准样品的标定提供技术支持。

01 罗非鱼湖病毒微滴式逆转录数字PCR检测

(1) RT-ddPCR 检测方法的建立

参照GenBank中登陆的TiLV第3 段全基因序列，选择hypothetical protein gene 基因作为靶位基因，设计合成了1 对引物和探针，以TiLV的cDNA为模板，通过优化反应，确定当引物和探针的浓度分别为500和300 nmol/L，退火温度为54.2 ℃时，建立的TiLV RT-ddPCR扩增反应效率最高、阴阳性微滴分布界限最明显、平均拷贝数较高。

(2) 标准曲线构建

RT-ddPCR与实时荧光RT-PCR检测方法在1~90 000 拷贝/μL范围内的线性关系较好（y=−3.7072x+39.894，R2=0.9958）。

(3) 敏感性、重复性和特异性实验

➤ 建立的RT-ddPCR 方法检测限低至 2 拷贝/μL，敏感性高；

➤ 检测变异系数低（4.86%），具有良好的重复性 ；

➤ 与其他5种常见的水生动物疫病病毒 (鲤浮肿病毒、锦鲤疱疹病毒、草鱼出血病毒、鲫造血器官坏死病毒、细胞肿大虹彩病毒) 阳性样品均未发生交叉反应，特异性强。

(4) 临床样品检测

48份罗非鱼临床样品的检测结果均为阴性，5份能力验证样品中3份为阳性，与能力验证满意结果一致。

研究建立的罗非鱼湖病毒微滴式逆转录数字PCR方法，敏感性高、特异性强、重复性好，从样品前处理至出具结果大概需要3小时，可作为罗非鱼湖病毒的定量检测技术。除能够准确定量检测罗非鱼湖病毒外，此检测方法也可应用于罗非鱼湖病毒标准样品的标定。将为罗非鱼湖病毒相关研究提供有益参考。

02 为什么选择检测罗非鱼湖病毒？

罗非鱼湖病毒是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的RNA 病毒，其可以感染罗非鱼的各个生长阶段，且发病快、死亡率高，目前尚无针对性的疫苗。2020 年，中国农业农村部与海关总署联合发布256号公告，将罗非鱼湖病毒病 (Tilapia Lake Virus disease, TiLVD) 列为《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》的二类动物疫病。目前，国内外已相继报道了关于TiLV的电镜观察、病毒分离培养，以及RT-PCR、巢式RT-PCR、半巢式RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR等多种分子生物学检测方法，但是在感染的早期阶段，鱼体内的病毒含量较低，很容易被忽略，因此更需要特异性强、敏感性高的检测方法。

03 关于数字PCR检测技术

概念：数字PCR技术是在荧光PCR检测方法的基础上发展起来的定量检测技术，称为第三代PCR技术。1999年，Vogelstein和Kinzler首次提出了数字PCR（Digital PCR, dPCR），可以将指数型函数转化成线性函数，对模板进行有限稀释，根据荧光信号的有或无进行精确定量。数字PCR检测技术是对传统PCR方法的技术革新，可以对核酸的拷贝数进行绝对定量，目前有微滴式数字PCR和微流控芯片数字PCR系统。

应用：数字PCR技术最早应用于结、直肠癌粪便样品中基因突变的检测。近年来，微滴式数字PCR技术在食品致病菌、动植物源性成分、遗传疾病的临床诊断、感染性疾病的诊断等领域得到了广泛应用。由于可以做到定量，在抗病毒药物治疗的效果评价中，通过治疗前后病毒含量的对比，可以直观地反映出药物的质量效果。数字PCR的灵敏度比对荧光PCR技术提高了约100倍，在致病菌的检测中可以不用培养，直接检测，提高了检出率，降低了实验室生物安全风险。目前，数字PCR检测技术已应用于登革热、布鲁氏菌、非洲猪瘟、H5亚型禽流感、牛冠状病毒、诺如病毒、新型冠状病毒等的检测中。在水生动物疫病的检测中也有鲤疱疹病毒2型、传染性鲑鱼贫血病毒等的应用报道。

04 微滴式数字PCR如何实现精准的核酸定量？

关键是微滴化处理（图1）。微滴式数字PCR将20 μL反应体系分成20 000个大小均匀的微滴，每个微滴的体积为1 nL。

▲ 图1 微滴式数字PCR精准核酸定量的关键——微滴化

注：a. 样品的制备；b. 样品加入微滴生成卡；c. 生成的微滴；d. 微滴同时进行PCR扩增；e. 记录样品中的阳性、阴性微滴的荧光信号；f. 阳性样品的结果显示。

所有20 000个微滴在一个反应管中同时进行PCR扩增。微滴分析仪可对微滴进行逐个检测，并确保检测结果的精确性与重复性。微滴分析仪会自动取样，并将样品中的所有微滴进行单行排列，微滴逐个通过双色荧光检测器，检测器会依次读取每个微滴的荧光信号，读取速度为1 000微滴/s，读取微滴的同时，QuantaSoft软件会记录每个样品中的阳性和阴性微滴的荧光信号，并以图形的方式显示。如果微滴中含有靶序列，则扩增结束后能检测到TaqMan探针标记的荧光信号。如果微滴内不含靶序列，PCR反应结束后则检测不到特定的荧光信号。通过记录并分析每个微滴的荧光信号，微滴式数字PCR可实现高精度的核酸定量，检测灵敏度可达单拷贝。在普通PCR仪上完成扩增后，对每个微滴的扩增进行终点检测。包含靶序列的微滴为阳性，不包含靶序列的微滴为阴性。通过阳性微滴所占的比例来最终确定样品中靶序列的浓度或含量。