球磨、超声和盐酸处理对几丁质的微观结构和酶促脱乙酰效率的影响

几丁质是地球上最丰富的天然含氮多糖，由β-1,4-糖苷键连接的N-乙酰氨基葡萄糖组成，广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的外骨骼和真菌的细胞壁中。壳聚糖是几丁质脱乙酰基后的产物，具有良好的可降解性、生物相容性、保水性、较高的载药性、可再生性、抑菌性、无毒副作用等特性。在食品领域，壳聚糖可用于海产品、果蔬制品和肉制品的保鲜，延缓淀粉老化，增加面包持水性和澄清果汁等。

为了打破几丁质的分子内和分子间的氢键网络，降低其分子质量，破坏其晶体结构，从而提高其酶促脱乙酰效率，河北农业大学肖宇、于宏伟、孙纪录*等人采用球磨、超声、盐酸3 种处理方法对几丁质进行改性。通过改性后几丁质在碱性溶液中的溶解度分别确定球磨和超声的最佳改性条件，进一步测定3 种改性几丁质的黏均分子质量，对几丁质微观结构进行表征；最后，探究3 种改性几丁质对其酶促脱乙酰反应是否起到促进作用。

1、球磨处理几丁质的条件优化

球磨转速对几丁质在碱性溶液中溶解度的影响

如图1所示，在约269 nm波长处观察到一个吸收峰，这是由于羰基或羧基的存在。 随着球磨转速的升高，269 nm波长处的峰发生了先红移后蓝移的现象，表明低转速下几丁质结构转变中π-π偶联逐渐增强，这是由于几丁质的扭曲构象变为相对平面构象，而高转速下的蓝移则可能是几丁质糖苷键断，π-π偶联减少或消失，游离羰基或羧基数量变多导致的。 同时，比较269 nm波长处不同样品的峰值，可以看出，球磨转速越高，几丁质样品吸光度越高，球磨转速1800 r/min的几丁质吸光度达到最大，可能是几丁质的降解、溶解度增加，同时糖苷键断裂会增加分子链末端和C＝O基团数量，从而增加了总吸光度。 以上结果证实了球磨改性可以提高几丁质在碱性溶液中的溶解度，并且球磨转速越高，溶解度越高。

球磨时间对几丁质在碱性溶液中溶解度的影响

如图2所示，随着球磨时间的延长，结果同转速增加趋势类似，269 nm波长处的吸收峰同样发生了先红移后蓝移。比较269 nm波长处不同样品的吸收峰值，可以看出，球磨时间越长，几丁质样品吸光度越强；球磨时间为45 min时，几丁质吸光度达到最大，同转速增加类似，一方面由于分子变小，溶解了更多的几丁质；另一方面糖苷键断裂产生了更多的吸光基团，从而增加了总吸光度。这一结果进一步证实了球磨改性可以提高几丁质在碱性溶液中的溶解度，并且球磨时间越长，溶解度越高。

根据球磨处理几丁质的条件优化实验结果，选择球磨转速为1800 r/min、处理时间为45 min的几丁质（BMC）用于后续实验。

2、超声处理几丁质的条件优化

超声输出功率对几丁质在碱性溶液中溶解度的影响

如图3所示，比较269 nm波长处不同样品的吸收峰值，可以看出，超声功率为400 W的几丁质吸光度达到最大，继续提升功率则吸光度变小，这可能是由于在处理过程中，超声能量通过空化作用传递，打破相对脆弱的几丁质纤维间氢键和范德华力，破坏了几丁质原有的分子链结构；然而，超声对几丁质类大分子物质的降解并不是随着超声强度的增加而无限发生，高强度的超声波导致反应体系中产生大量的空化泡，其聚集在探头附近，阻碍了能量的传递，产生能量衰减效应，导致几丁质结构断裂效率下降；此外，超声改性结束后，需要将样品冻干，这可能会使几丁质的晶体结构和分子结构得到恢复，从而造成几丁质溶解度降低的现象。

超声时间对几丁质在碱性溶液中溶解度的影响

如图4所示，比较269 nm波长处不同样品的吸收峰值，可以看出，随着超声时间的延长，几丁质样品吸光度逐渐增加；超声时间为45 min时，几丁质吸光度达到最大，这是超声的空化效应和超声对几丁质链直接作用的共同结果。

根据超声处理几丁质的条件优化实验结果，选择超声输出功率为400 W、处理时间为45 min的几丁质（USC）用于后续实验。

3、3 种改性方法对几丁质的特性黏度和黏均分子质量的影响

黏均分子质量是聚合物表征的关键参数，会影响聚合物的生物学效应和力学性能。一般来说，机械处理不可避免地会导致分子链断裂和分子质量降低。分子质量的降低是由于糖苷键的断裂，糖苷键断裂后会产生自由基，而自由基的产生又会进一步诱导其他自由基的形成，从而有利于几丁质的进一步降解，提高其溶解度。由表1可知，与原几丁质（RC）相比，超声几丁质（USC）、几丁质（BMC）和胶体几丁质（CC）的特性黏度分别降低了5.17%、78.98%、69.60%；USC、BMC和CC的黏均分子质量分别降低了7.31%、88.14%和82.81%。由此可以看出，BM和盐酸处理会显著降低几丁质的特性黏度和黏均分子质量。

4、3 种改性方法对几丁质微观结构的影响

傅里叶变换红外光谱分析结果

由图5可知，各几丁质红外光谱吸收峰的主要差异在于某些特征峰的增强、减弱或者消失，表明改性后几丁质的分子结构、空间结构或排列发生了变化。从图5可以观察到α型几丁质的典型吸收峰（896、1315、1550、1627、1662 cm-1等）。在3448 cm-1附近的吸收峰由O—H伸缩振动引起，3263 cm-1附近的吸收峰是由N—H伸缩振动引起，这两个吸收峰受氢键的影响较大。BMC和CC与RC相比，在3448 cm-1和3263 cm-1附近吸收强度提高，波数范围变宽，说明游离O—H与N—H数量变多，氢键类型更为多样，表明球磨处理和盐酸处理均破坏了RC之间氢键网络，使更多的羟基基团暴露，而超声处理对几丁质的影响并不明显。1627 cm-1与1662 cm-1处分别是由几丁质C＝O缔合态与游离态附近伸缩振动引起的吸收峰，其中BMC和CC游离态吸收峰强度明显变大，说明大量游离C＝O产生，波数范围变宽，说明氢键形式更为多样；1550 cm-1处是C＝C或C＝N伸缩振动引起的吸收峰，BMC和CC游离态吸收峰强度变大，波数范围变宽，结合紫外吸收光谱分析结果，说明几丁质结构转变π-π偶联现象逐渐增强，1315 cm-1处为C—N伸缩振动引起的吸收峰，吸收峰强度变大，C—N数量增多，1160～1020 cm-1为C—O伸缩振动引起的吸收峰，896 cm-1附近的吸收峰是由几丁质的β-糖苷键伸缩振动引起的，896 cm-1处的吸收峰强度增加，表明球磨处理和盐酸处理均可能使几丁质中的部分糖苷键断裂，而超声处理主要以破坏几丁质中的氢键为主，这与黏均分子质量分析结果一致。

脱乙酰度分析结果

由表2可知，USC、BMC的脱乙酰度从7.38%分别增加到8.52%、8.15%，CC的脱乙酰度降低到4.17%，表明BM和US改性后几丁质的乙酰化程度略有降低，盐酸处理后几丁质的乙酰化程度提高，原因可能是盐酸处理使几丁质的结晶度降低。有研究表明，乙酰基会在结晶度较低、比表面积较大的改性几丁质中保留。

X射线衍射分析结果

由图6可见，所有样品均能观察到在2θ为9.2°处的（020）晶面和2θ为19.2°处的（110）晶面存在两个特征尖峰。经过3 种改性方法处理后，峰的强度均有所降低，说明样品中的微观结构已被破坏。其他4 个弱峰出现位置对应的2θ分别约为12.6°（101）、20.7°（120）、23.4°（130）和26.2°（013），这些峰的强度也有所下降，甚至有些峰在BMC中几乎观察不到。定量分析表明，USC、BMC、CC的结晶度分别降低至90.72%（结晶度指数为62.36%）、73.04%（结晶度指数为28.72%）、94.5%（结晶度指数为69.53%），均低于RC的96.30%（结晶度指数为78.98%）。结晶度的降低与分子内及分子间氢键数量的减少密切相关，结合FTIR光谱分析结果，球磨处理对几丁质晶体结构破坏较完全，盐酸处理虽能够断裂糖苷键，但几丁质基本晶体结构保留，超声处理对几丁质破坏最小。

热重-差示扫描量热分析结果

图7A为几丁质样品的TG曲线，尽管所有的样品都在处理前于100 ℃条件下烘干了4 h，但它们在热重分析温度升至120 ℃之前均发生了轻微的质量损失，这是几丁质中的结合水和吸收水蒸发造成的。200～450 ℃是样品质量损失率最高的阶段，几丁质在该阶段发生分解。由于经过球磨处理和盐酸处理的几丁质粒径明显减小，其受热面积增大，受热更加均匀，使其分解速率加快。450 ℃之后，几丁质的热解残余物开始缓慢分解成碳和灰分，同前面测定结果一致，说明球磨、盐酸处理对几丁质破坏较大。

图7B为样品的DSC曲线，能够反映几丁质主链的降解情况。由图7B可见，所有样品均在200 ℃之前有较宽的吸热峰。4 个样品的峰值不同，可能与几丁质结晶度有关。USC、BMC和CC的峰值分别在156.85、160.56 ℃和170.89 ℃，较RC的峰值出现有所延迟，这是因为几丁质结晶度的降低能够使其吸水性增强，从而导致峰值延迟出现。

SEM观察结果

由图8可见，3 种改性几丁质的微观结构较未经过处理的几丁质有明显区别。原因可能是3 种改性方法都破坏了几丁质的糖苷键及糖链内与链间的氢键作用，导致更多的活性基团暴露，分子质量降低，聚合度变小，使其结构变得疏松。RC表面光滑、结构致密、孔洞分布均匀（图8A）；USC表面被撕裂，出现蜂巢形的多孔性特征（图8B）；BMC呈现出堆叠结构，表面粗糙，孔隙细小、不规则（图8C）；CC表面有明显塌陷，结构变得疏松多孔（图8D）。以上结果表明，3 种改性方法均对几丁质的结构有明显影响。

5、3 种改性方法对几丁质的CDA酶促脱乙酰效率的影响

如图9 所示，CDA 降解4 种样品的乙酸产量依次为BMC（32.57 μg/L）＞CC（14.20 μg/L）＞RC（9.58 μg/L）＞USC（3.45 μg/L）。在酶促脱乙酰过程中，USC的乙酸产量比RC降低了6.13 μg/L，其原因可能是超声处理后的样品经过冻干后，几丁质的分子结构不仅会恢复，甚至会变得更复杂，导致其比RC更难脱乙酰，乙酸产量更低。其原因是球磨处理和盐酸处理能够使几丁质黏均分子质量降低，结晶度减小，主链断裂，分子间网络结构被破坏，从而形成疏松的网状多孔结构。这些理化性质和微观结构的变化均有助于提高几丁质的溶解度，并可能使更多酶与底物的结合位点暴露，从而提高酶促脱乙酰效果。

结论

为了打破几丁质的氢键网络，降低其分子质量，破坏其晶体结构，从而提高几丁质的酶促脱乙酰效率，本实验确定了球磨、超声改性的最佳条件，并研究了球磨、超声、盐酸处理对几丁质理化特性和微观结构的影响。结果表明，球磨改性最佳条件为1800 r/min、45 min，超声改性最佳条件为400 W、45 min；几丁质经球磨和盐酸改性处理后，平均粒径和黏均分子质量均降低，结晶度减小，分子间氢键网络被破坏，更多的羟基基团暴露，部分糖苷键断裂，热稳定性降低，并且形成了网状多孔结构，从而暴露出更多的结合位点。与RC相比，经球磨、盐酸改性的几丁质更易被CDA降解。此外，球磨、超声改性后几丁质的脱乙酰度有所提高，这为几丁质制备壳聚糖提供了一个可能的研究方向。综上，球磨作为一种操作简单且对环境友好的处理方式，能有效改善几丁质的理化和结构特性，可作为促进几丁质制备壳聚糖的一条有效途径，同时提高几丁质的应用潜力。