两种给药途径土霉素残留在鲫鱼体内的消除规律

两种给药途径土霉素残留在鲫鱼体内的消除规律

郭海燕1,2，张其中2,3，李雪梅2

（1.重庆市水产科学研究所；2.西南大学生命科学院；3.暨南大学生命科学技术学院）

摘要 本文探讨了在肌肉注射和口灌给药方式下土霉素残留在鲫鱼组织内的消除情况。结果表明：鲫鱼肌肉注射和口灌给药后土霉素在体内的最大浓度依次是：肌肉4.636mg/kg和2.869mg/kg，血液5.467mg/kg和3.112mg/kg，肝脏7.165mg/kg和5.086mg/kg，肾脏8.308mg/kg和5.017mg/kg；肌肉注射第288h时除肾脏中的土霉素浓度仍然高达0.375mg/kg，其他组织中已经检测不到土霉素的存在，而口灌给药第288h时肌肉、血液、肝脏、肾脏中土霉素的浓度依次为：0.133 mg/kg，0.237mg/kg，0.272mg/kg，0.272mg/kg。因此，在（10±1）℃水温条件下，以剂量50mg/kg鱼体重单次给药，肌肉注射各组织内的药物浓度比口灌给药高，口灌给药消除速度比肌肉注射慢。本次实验结果建议在（10±1）℃以上水温条件下，无论肌肉注射还是口灌给药，建议第12天以后捕鱼食用是安全的。

关键词 土霉素；残留；消除；鲫鱼

在鱼类防病治病中，土霉素（Oxytetracycline, OTC）因价格低廉、抗菌谱广、抗菌力强应用尤为广泛。随着此类药物的广泛应用，其残留对环境卫生和公众健康的潜在危害已成为严重问题。最常见的四环素类不良作用有皮肤损伤和光敏性皮炎，免疫抑制影响，能导致肝损害，长期使用会使细菌的抵抗力增强等等。所以，鱼产品中的药物残留已成社会关注的焦点。当前对土霉素含量的检测方法多采用高效液相色谱法，但由于仪器昂贵，难以在生产实践中推广，本研究建立了用紫外分光光度法检测鲫鱼体内土霉素残留的快速检测方法，该法操作简便、快速、回收率高、重现性好。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验用鱼

健康鲫鱼(Carassius auratus)，由重庆北碚渔民提供，体重（70±6）g。实验前驯化两周，每日换水，投喂饵料、浮萍，水温为（10±1）℃。

1.1.2实验药品及仪器

土霉素标准品，纯度≥99.5%，中国兽药监察所生产；土霉素片，西南药业股份有限公司生产，批号（2003）030406；磷酸氢二钠（A.R）、三氯乙酸（A.R）、三氯甲烷（A.R）、正已烷（A.R）；紫外分光光度计UV－240、匀浆机、离心机、电子天平、冰箱。

1.2提取液和标准溶液的配制

提取液的配制：称取磷酸氢二钠3.58g溶于500ml水中配成0.02mol/L的溶液，再将4.0g三氯乙酸溶于100ml0.02mol/L的磷酸氢二钠溶液即为4%的提取液（临用前配制）。

标准溶液的配制：将25.0mg的OTC标准品，溶于250ml提取液中，配成100μg/ml的母液。

1.3方法

1.3.1给药方法及采样

将实验用鱼分为两组，分别以土霉素肌肉注射一次和口灌给药一次，剂量为50mg/kg。在给药后第0h，0.5h，1h，2h，4h，8h，16h，32h，48h，72h，144h，288h，各取样一次，在每一时间点取血液、肌肉、肝脏、肾脏，每次3－4条鱼。

将鲫鱼侧卧固定，破坏脑脊髓，尾静脉取血，收集血样。待血液凝固后，分离出血清，吸取1ml，-20℃保存。取血后，快速取肝脏、肾脏、躯体两侧背鳍附近的肌肉各1g，充分剪碎，-20℃保存。

1.3.2标准曲线的制备

用4%的提取液稀释土霉素标准品母液，分别制成0μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml浓度的标准溶液，用分光光度计测定OD值。以标准溶液浓度为横坐标，相应的OD值为纵坐标，求出回归方程和相关系数。

1.3.3样品处理

样品解冻后，依次加入1ml的三氯甲烷和2ml4%三氯乙酸的磷酸氢二钠提取液，10000r/min匀浆2min，用2ml提取液清洗刀头，合并提取液，振荡1min，5000r/min（肝脏样品为8000r/min）离心10min。取全部上清液，用正已烷去脂肪后同样条件下离心，取上清液，再次去脂肪，充分混合后静置，取其下层澄清液，用紫外分光光度计测定360nm处的OD值。

1.4方法的可靠性评价

1.4.1样品中内源性物质对OD值影响的测试

实验分两组，一组在4ml提取液中加入OTC标准溶液1ml，另一组把相同的标准溶液1ml分别加到含有4ml提取液的血液、肝脏、肾脏、肌肉组织中，每种组织测定10个样品，两组都按1.3.3样品处理方法处理，用没加土霉素标准溶液的提取液作为对照，测定OD值。

1.4.2 回收率的测定

实验分两组，一组将空白组织（血液、肝脏、肾脏、肌肉）0.5ml或g依次加入1ml浓度为5μg/ml、10μg/ml、15μg/mlOTC标准溶液，按样品处理方法处理；另外一组将同样量的空白组织先按样品处理方法处理，再加入1ml浓度为5μg/ml、10μg/ml、15μg/mlOTC标准溶液，测定OD值。同样的步骤重复三次。按回收率计算公式计算：

回收率（%）＝（处理前加入标液样品的测定值/处理后加入标液样品的测定值）*100%

2 结果

2.1 土霉素标准浓度与OD值的标准曲线

以标准溶液浓度作为横坐标，相应OD值为纵坐标，在0～25μg/ml范围内，求得回归方程和相关系数分别为：Y=0.00116+0.02887X， R=0.99981。

2.2 肌肉注射和口灌给药组织中OTC浓度分析

鲫鱼肌肉注射第0h时各组织中检测不到药物，第0.5h可以检测到，肌肉、血液、肝脏、肾脏中土霉素的浓度依次是：0.029mg/kg，0.687 mg/kg，0.341mg/kg，0.202mg/kg；血液、肝脏、肾脏第8h时、肌肉第16hOTC浓度达到最大值，依次是：5.467 mg/kg，7.165mg/kg，8.308mg/kg，4.636 mg/kg；随后各组织中OTC的浓度逐渐下降，而肝脏中的OTC浓度在32h~72h之间时有一个回升；第288h时肾脏中的OTC浓度为0.375 mg/kg，其它组织中已检测不到OTC的存在（如图1）。

鲫鱼口灌给药第0h时各组织中检测不到药物，第0.5h的肌肉中仍然检测不到OTC的存在，血液、肝脏、肾脏中OTC浓度依次为：0.029 mg/kg，0.098mg/kg，0.168mg/kg；肌肉、血液、肝脏第16h、肾脏第32hOTC浓度达到最大值，依次为：2.869mg/kg，3.112mg/kg，5.086mg/kg，5.398mg/kg；随后肌肉、血液、肾脏中OTC的浓度逐渐下降，而肝脏中的OTC浓度在32-48h之间有一个回升；第288h时肌肉、血液、肝脏、肾脏中OTC的浓度依次为：0.133mg/kg，0.237mg/kg，0.272mg/kg，0.272mg/kg（如图2）。

3.讨论

3.1检测方法可靠性分析

3.1.1土霉素分子结构分析

土霉素分子结构中含有两个共轭双键系统，具有吸收紫外光的特点。这是能用紫外分光光度计检测的分子结构基础。

3.1.2样品中内源性物质对OD值影响的测试

记录测定的空白提取液（未加血液或任何其它组织在内）、肌肉加提取液、血液加提取液、肝脏加提取液、肾脏加提取液之间的OD值，用T检验法分别对其进行检验，得到的结果分别为：P1=0.288、P2=0.219、P3=0.091、P4=0.090， P1、P2、 P3 、P4 值均大于0.05，表明不加任何组织的提取液的OD值和加入了组织的提取液的OD值间差异不显著。

3.1.3回收率的测定

用5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml的OTC标准溶液分别测定在血液、肌肉、肝脏、肾脏中的平均回收率，分别为：81.43%，81.90%，79.29%，81.60%，都接近80%，表明平均回收率高且稳定。

3.2鲫鱼对土霉素的分布和吸收

土霉素在鲫鱼体内分布较广，能迅速地分布到各组织中。肌肉中最迟检测到OTC的存在，并且肌肉中的OTC浓度明显低于肝脏、肾脏中的OTC浓度，这与以前的研究结果是一致的。这种现象是由不同组织中血液循环速度不同引起的，血液在肝脏、肾脏等组织中的循环速度较快，在肌肉等组织中循环速度较慢，因此药物分布至肌肉的速度也较慢。

鲫鱼肌肉注射后第0.5h时肌肉中可以检测到OTC，口灌给药后第0.5h时肌肉中未检测到OTC的存在，肌肉注射后相应的血液、肝脏、肾脏中OTC浓度比口灌给药后要高；肌肉注射后血液、肝脏、肾脏中第8h、肌肉中第16h时OTC浓度达到最大值，口灌给药后肌肉、血液、肝脏第16h 时、肾脏第32h 时OTC浓度达到最大值。可见，肌肉注射鲫鱼对土霉素的吸收比口灌方式快。

本实验是对两种不同给药方式下土霉素在鲫鱼血液和各组织中浓度的检测，所得的具体数据虽有所不同，但土霉素在肝脏中OTC的吸收都存在着重吸收现象，这与李美同和田中二良等的研究结果相似。

3.3土霉素在鲫鱼体内的消除和残留

鲫鱼肌肉注射各组织内的OTC浓度比口灌给药高。肌肉注射和口灌给药后土霉素在体内的最大浓度依次是：肌肉4.636mg/kg和2.869mg/kg，血液5.467mg/kg和3.112mg/kg，肝脏7.165mg/kg和5.086mg/kg，肾脏8.308mg/kg和5.017mg/kg；口灌给药土霉素消除速度比肌肉注射要慢，肌肉注射第288h时除肾脏中的OTC浓度仍然高达0.375mg/kg，其它组织中已经检测不到OTC的存在，口灌给药第288h时肌肉、血液、肝脏、肾脏中的浓度依次为：0.133mg/kg，0.237mg/kg，0.272mg/kg，0.272mg/kg。

药物往往因为在血液中的循环途径不同，影响到以后的分布和消除，这方面主要取决于是否通过肝脏。口灌药物时因吸收的药物全从肠壁进入门静脉系统，故首次循环要经过肝脏；肌肉注射时首次循环不经肝脏而直接进入体循环[13]。药物受肝脏首过作用后，进入体循环的有效药物量相对肌肉注射较少；此外，可能口灌给药的药物吸收也不完全。因此，肌肉注射各组织内的药物浓度比口灌给药途径的高。

水温是影响药物代谢的重要因素。本实验在（10±1）℃水温条件下完成，温度较低，实验鱼新陈代谢较高温下慢，药物代谢速度也慢，所得残留消除时间应比高于这一温度的时间长。所以，以这一时间为标准制定起捕前的休药期是安全的。

我国农业部[1994]和联合国粮农组织[FAO1991]规定OTC的最高残留限量（Maximum residue limit, MRL）在鱼肉中为0.1mg/kg，鱼肝为0.3mg/kg。本次研究结果表明在（10±1）℃水温条件下，以剂量50mg/kg鱼体重单次给药，肌肉注射第144h（6天）时，除肝脏中的含量仍然偏高外，其它组织中OTC的含量已经较低；口灌给药第288h（12天）时肌肉中仍然有少量残留。因此，在（10±1）℃以上水温条件下，无论注射还是口灌给药，建议第12天以后捕鱼食用是安全的。