鱼用疫苗浸泡免疫途径的研究概况

随着疫苗产业的不断发展，鱼类免疫逐渐产生了注射、浸泡和口服3种途径。本文从免疫机理和提高免疫效果等方面对浸泡免疫途径进行综述，同时对水产疫苗的研究前景进行展望。

1.浸泡免疫

浸泡免疫是将鱼体直接放入特定浓度的疫苗液中，经过一定时间浸泡，让抗原通过浸泡进入鱼体，刺激其产生免疫应答。浸泡免疫具有操作简单、对鱼体损伤小且可结合鱼体运输等优点。目前浸泡方式有3种，分别为高渗浸泡、直接浸泡和喷雾免疫方式。高渗浸泡是短时间利用尿素或氯化钠对鱼体进行高渗脱水，再将其放入疫苗溶液中，让鱼体能较快吸收，产生免疫反应。直接浸泡较为简单，只需要将鱼体放入疫苗溶液即可。此两种浸泡方式各有优劣，高渗浸泡能够提高鱼体摄食抗原的能力，同时也能提高鱼体的保护率，但对鱼体伤害较大，会对鱼体产生较大刺激。贺路等(1999)在实验过程中认为浸泡免疫能达到较好效果，能明显提升鱼体成活率。而Tatner等(1983)、Anderson(1979)却认为浸泡免疫效果不明显，无法起到应有的效果。喷雾免疫是利用一定浓度的疫苗溶液直接雾化喷射鱼体的一种免疫方法，最初用于弧菌疫苗免疫鱼体，且免疫鱼体大小不限，能够免疫大于20克/尾的鱼。Gould等(1978)认为喷雾压力大小不影响其免疫效果，均能达到要求。然而，喷雾免疫也存在较大不足，其操作程序较多，要经过捕捞、运送、喷雾等环节(Robles R等，1998)，会对鱼体产生较大的刺激。

其他的方法如淋浴和冲洗(Anderson D P等，1979)进行免疫鱼体，均能起到一定的效果。淋浴免疫的优势就是对免疫鱼体的刺激小，但是需要大量的疫苗(Nakanishi T等，1997)。用灭活驼背石斑鱼神经坏死病毒(HGNNV)作为疫苗来淋浴免疫橙点石斑鱼，用二甲基亚砜灭活HGNNV作为疫苗，以TCID50为107个/毫升免疫鱼体120分钟，免疫后30天和90天的相对存活率分别为87%和82%，可以很好地证明淋浴免疫的有效性(Kai Y H等，2008)。

2.浸泡免疫机理

鱼类作为低等脊椎动物，其免疫防御系统调控基因以及基因控制产物同高等脊椎动物基本相似，具有相关组织、细胞及分子行使免疫功能(Hashimoto I等，1990；Secombes C J等，1996)。系统免疫和黏膜免疫共同完成鱼类疾病的防御功能。

鱼类是生活在水环境中的群生动物，其鳃、皮肤及肠道等黏膜组织往往是与外界环境首先接触到的，并且接触面积最大(Dalmo R A等，1997)，在自然状况下，也是大多数病原入侵时首先接触的部位。因此，鱼的鳃、皮肤黏膜组织不仅具有非特异性免疫功能，同时也具有特异性的免疫应答功能(Dos Santos N M S等，2001；Xu D H等，2002)。另外，鱼的黏膜组织及其分泌黏液中含有丰富的非特异性免疫因子(Bergsson G等，2005；Mulder I E等，2007)，与特异性抗体蛋白共同构成抵御病原微生物侵入的第一道防线。解剖学研究表明，鱼的皮肤由内层的真皮层、外层的表皮、衍生物及附属结构组成，其中表皮主要由上皮细胞组成，分布有黏液细胞和囊状细胞(Press C M等，1999；Fast M D等，2002)。罗晓春等(2005)发现在斜带石斑鱼表皮和真皮层之间，游离着许多白细胞和淋巴细胞，Lobb(1987)在河鲇的皮肤中也发现有淋巴细胞的存在，利用单克隆抗体免疫组化标记技术发现，在受精两个半月以上的鲤鱼皮肤中发现一定数量的T细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞。此外，Xu等(2002)研究表明，皮肤表皮中存在抗体分泌细胞。Vervarcke等(2005)用弧菌全菌疫苗浸泡非洲鲇，则在免疫鱼的体表黏液中检测到抗体蛋白。上述结果表明，在一些鱼的皮肤中存在着免疫功能细胞，但此细胞是否起源于皮肤组织，则有待于进一步的研究。另外，在鱼的皮肤组织及分泌黏液中存在许多非特异性免疫因子，如水解酶、菌酶转移因子、几丁质、C-反应蛋白、凝集素等。

鳃组织中存在有大淋巴细胞、小淋巴细胞、巨噬细胞、杯状细胞、中性粒细胞等各种细胞。Lin等(1999)认为虹鳟的鳃组织存在巨噬细胞，具有明显的吞噬活性。华育平等(2005)认为史氏鲟的鳃组织中存在溶菌酶。在大西洋鲑的鳃组织中也存在协助抗原呈递的巨噬细胞。

目前大量研究表明，黏膜免疫反应可以独立于系统免疫反应，而产生局部的免疫应答，即能够独立完成对抗原的识别、捕捉、呈递和抗体分泌等一系列反应的特异性免疫应答全过程，利用浸泡免疫能够引起鱼体的免疫过程一般以黏膜免疫反应为主。Esteve-Gassent等(2004)研究表明，浸泡免疫后鱼的鳃、皮肤和肠黏膜组织表面黏液中抗体水平、抗体分泌细胞数量均显著增加，能引起较为明显的免疫应答，而系统免疫反应较弱，且反应时间晚于黏膜组织。Moore等(1998)发现抗原的摄取量随着浸泡浓度的增加而增加。抗原主要被鳃和皮肤摄取，通过对二者的形态学观察，鳃上的抗原颗粒主要由吞噬细胞摄取，而皮肤中的抗原先出现在皮肤柱状上皮中，则可推测巨噬细胞完成抗原的识别和呈递。学者们经过不懈努力，在草鱼、斑马鱼、驼背犬齿罗非鱼、大西洋鲑等头肾中克隆到了MHCⅡ的cDNA(Walker R A等，1994)，说明鱼类存在具有功能性的MHCⅡ基因。Morrison等(2006)采用免疫组化原位标记的方法，用Neoparamoeba.sp.悬液浸泡免疫大西洋鲑，在免疫鱼鳃组织中检测到MHCⅡ阳性细胞。

根据鳃组织的细胞组成，研究者认为鳃具有独立免疫应答能力。Santos等(2001)用全菌疫苗浸泡免疫石齿鲈幼鱼，发现在免疫鱼鳃组织中不同时间点抗体分泌细胞的数量呈现应答动力学规律。同时Lumsden等(1995)用黄杆菌浸泡免疫虹鳟，通过ELISPOT检测发现鳃上的ASC要比外周血ASC的比例明显偏高。

3.提高浸泡免疫的措施

(1)超声。超声方法是在鱼类免疫途径中新应用的一种技术。超声是一种高于20 000赫兹的高频声波，方向性好、穿透力强，应用于浸泡免疫中，能够提高细胞的渗透作用。Zhou等(2002)利用超声技术将溶藻弧菌疫苗免疫青石斑鱼，在恰当的时间和恰当的频率下，发现浸泡免疫的保护效果相当于注射免疫的效果。同样关于鲷鱼方面的实验也得到了类似的结果(Zhou等，2002)。Navot等(2004)以金鱼为实验材料，比较超声技术与高渗浸泡两种方法下，鱼体对BSA的摄食量。结果表明，超声处理要比高渗浸泡的免疫效果好，而且疫苗用量是高渗浸泡的1/5。

(2)弱毒疫苗。弱毒疫苗是由致病性大为减弱的减毒株所制备的疫苗。常用的此类疫苗有VHSV的F25(21)抗热株疫苗、IHNV减毒疫苗(Fryer J L等，1976)、CCV减毒疫苗(Walczak E M等，1981)，疖疮病减毒疫苗及草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗(许淑英等，1994)等，具有免疫原性好、免疫持续期长、使用剂量小等优点，但对其安全性尚有疑虑。

4.前景展望

经过以上对浸泡免疫的免疫机理进行的阐述可以得知，注射免疫主要引起的是鱼类的系统免疫；口服免疫既可以引起系统免疫，又可以引起黏膜免疫，但主要是黏膜免疫；而浸泡免疫则主要引起的是黏膜免疫反应。免疫接种与药物治疗相比，具有安全性、无污染、在鱼体内没有残留、不会产生耐药等一系列优势。随着疫苗研究的深入，各种疫苗随即问世，如联苗、多价疫苗以及基因工程疫苗等。为了使鱼类疫苗的发展能够更科学，更有实用意义，延长其免疫应答时间(杨先乐等，1993)，研究鱼类接种疫苗后机体相关的免疫应答机理是制定生产中合理免疫方案的重要理论基础。

比较注射、口服以及浸泡免疫3种免疫途径的机理及优缺点发现，如果在未来的研究中，人们能够研发出一种既有注射免疫的免疫效果，又能避免疫苗在鱼体内的消化破坏，同时在生产实践中操作简便，使用的疫苗量也少的疫苗，不失为疫苗研究领域中的一个突破性的进展。这有待于对鱼类疫苗及鱼类免疫机理进行深入研究。

比较注射、口服以及浸泡免疫3种免疫途径的机理及优缺点发现，如果在未来的研究中，人们能够研发出一种既有注射免疫的免疫效果，又能避免疫苗在鱼体内的消化破坏，同时在生产实践中操作简便，使用的疫苗量也少的疫苗，不失为疫苗研究领域中的一个突破性的进展。这有待于对鱼类疫苗及鱼类免疫机理进行深入研究。