论文：大黄抑制水产致病菌的研究进展

大黄抑制水产致病菌的研究进展

杨宏亮1，黄 珂1，田 珩2，王 强1，王旭峰1，古小莉1

( 1.中国水产科学研究院 南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室,广东 广州 510399; 2.广东省药品检验所,广东 广州 510180 )

大黄；抗菌作用；中药；渔药

近年来我国水产养殖业蓬勃发展，渔业产值逐年不断增加,但水产致病菌导致的病害也不断大规模爆发。防治水产致病菌最常用的方法仍为使用各种抗生素和合成抗菌药。而药物的滥用又会导致环境污染、食品安全等一系列问题。研制新型水产抗菌药便成为研究的一大热点。研究传统中药的抗菌作用是寻找高效、环境友好、对人类无致病作用的新型水产抗菌药的一条捷径，而其中的大黄(Rheum)是目前较有潜力的抗菌中药之一。

1 大黄的应用现状

1.1 传统中医理论指导下大黄的临床应用

大黄是我国传统中药材之一，应用已久，始载于我国现存最早的药学专著《神农本草经》，因其植株大，根切片色黄，故名大黄[1]。民间将大黄归为我国中药四大天王之一，在我国有广泛的种植基础，价格也很低廉。广义的大黄在我国有45个品种和2个亚种。《中国药典》正品大黄为蓼科植物掌叶大黄(R.palmatum)、唐古特大黄(R.tanguticum)或药用大黄(R.officinale)的干燥根和根茎。秋末茎叶枯萎或次春发芽前采挖。除去细根，刮去外皮，切瓣或段，绳穿成串干燥或直接干燥。苦，寒。归脾、胃、大肠、肝、心包经。泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄。用于实热积滞便秘，血热吐衄，目赤咽肿，痈肿疔疮，肠痈腹痛，瘀血经闭，产后瘀阻，跌打损伤，湿热痢疾，黄疸尿赤，淋证，水肿；外治烧烫伤。大黄即可生用，也可酒炙(酒大黄)，酒炖或酒蒸(熟大黄)，炒黑用(大黄炭)。酒大黄善清上焦血分热毒，用于目赤咽肿，齿龈肿痛。熟大黄泻下力缓，泻火解毒，用于火毒疮疡。大黄炭凉血化瘀止血，用于血热有瘀出血症[2]。

1.2 大黄的兽用

大黄也广泛用作兽药，《中国兽药典》[3]收录了大黄及其制剂大黄末、大黄酊、大黄流浸膏、大黄碳酸氢钠片等。大黄兽用具有泻热通肠、凉血解毒、破积行瘀的功效，主治实热便秘、结症、疮黄疔毒、目赤肿痛、烧伤烫伤、跌打损伤、鱼烂鳃、腐皮、肠炎等。其兽用作用与中国药典人用时的作用相似。值得指出的是，中国药典中人用剂量为3～15 g，而兽药典中兽用剂量为：马、牛30～120 g，驼30～90 g，羊、猪6～12 g，犬、猫3～5 g，兔、禽1.5～3 g。鱼每千克体质量5～10 g，拌饵投喂；每立方米水体2.5～4 g泼洒鱼池[3]。

1.3 大黄在治疗水生生物疾病中的应用

水产养殖对象均生活在水环境中，在制剂类型和给药方式有其特殊性。大黄在水产养殖中也多有应用，除上文提到的药材直接用药外，2010年版《中国兽药典》[3]中涉及到水产用的单味或成方制剂只有5个品种，其中大黄末、穿梅三黄散、蚌毒灵散、大黄芩鱼散等4个品种均有大黄入药。我国第一批兽药标准转正目录[4]的35个水产用中药品种中，又有山青五黄散、双黄苦参散、双黄白头翁散、三黄散、加减消黄散、大黄五倍子散、青连白贯散、清热散、七味板蓝根散等12个品种(包含兽药典中3个品种)含有大黄组分。而在后续的3个兽药标准转正目录中仅新增了9个水产用中药品种。其中又有大黄芩蓝散、蒲甘散、板蓝根大黄散、大黄解毒散、石知散等5个品种含有大黄组分。大黄是现行水产养殖用药中应用最广的中药材。这些中药组方主要以清热解毒为主，主治包括细菌性烂鳃、肠炎、赤皮病、败血病、腐皮病、烂尾病、烂肢病、疖疮、打印病、病毒性出血病等水产常见病。

2 大黄提取物的抗菌作用

近年来，针对大黄及其有效成分的抗菌作用的研究也很多，根据《伯杰氏细菌系统分类学手册》[5]的分类方法，文献涉及到的菌种主要包括表1所示的几类菌，其中变形菌门和拟杆菌门属于革兰氏阴性菌，厚壁菌门属于革兰氏阳性菌。可见，大黄的抗菌范围较广，革兰氏阴性菌和阳性菌对其均敏感，其中革兰氏阴性菌所占比例更高。大黄有效成分的抑菌作用可能有多种机理，与细菌细胞壁的作用可能只是其中一个方面。

2.1 大黄抑菌的作用机理

目前对大黄抑菌机制的研究较少。大黄抑菌效果与其有效成分的分子结构密切相关。研究表明，大黄抑菌的主要成分可能为蒽醌类化合物，主要抑制细菌细胞线粒体呼吸电子传递，抑制菌体糖及糖代谢中间产物的氧化和脱氢过程，影响组织细胞生命活动所需能源的供应，并与DNA结合，干扰其模板功能，抑制蛋白质和核酸合成，降低生物膜的稳定性，干扰能量代谢的酶促反应。大黄也可能通过多种成分、多个抑菌途径共同起作用。

2.2 大黄的抑菌效果

文献报道的大黄具体抗菌效果见表2、表3，现综述如下：

2.2.1 假单胞菌属(Pseudomonas)

荧光假单胞菌(P.fluorescent)属于需氧的革兰氏阴性菌，是鱼类赤皮病的病原菌。何爱华等[10]采用滤纸法检测了大黄的抑菌圈直径，大黄水提物(质量浓度50 mg/mL)对生物I-荧光假单胞菌的抑菌圈直径为(8.8±0.24) mm，测得其最小抑菌质量浓度为11 mg/mL，效果仅次于黄连，好于连翘等其他4种中药。

2.2.2 希瓦氏菌属(Shewanella)

腐败希瓦氏菌(S.putrefaciens)是一类需氧的革兰氏阴性菌，可以引起鱼类肝淤血、脾肿大等疾病。李忠琴等[20]从养殖病鳗(Anguilla)中分离到4株腐败希瓦氏菌，检测到大黄的最低抑菌质量浓度均为0.75 mg/mL，显示了很好的抑菌效果。李华等[21]研究了大黄对可致仿刺参(Apostichopusjaponicus)化皮病的黄海希瓦氏菌(S.marisflavi)的抑菌效果，其最低抑菌质量浓度为25 mg/mL，不及五倍子的0.78 mg/mL，但好于苦参等中药。

2.2.3 弧菌属(Vibrio)

弧菌属细菌为一类需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌，是引起许多海水养殖动物高死亡率的主要原因之一[6]。副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)是临床常见致病菌，可分泌多种溶血素使鱼类致病[7]，还可引起人食物中毒。鳗弧菌(V.anguillarum)是条件致病菌，在不良的环境条件下，水产养殖动物遭遇不利刺激或是受伤时可致病。鳗弧菌可感染鲑鱼(Oncorhynchus)、虹鳟(O.mykiss)、鳗鲡(A.japonica)、香鱼(Plecoglossusaltivelis)、鲈鱼(Lateolabrax)、鳕鱼(Gadus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)等鱼类，出现典型败血症，病鱼体表、鳍、内脏等出血，严重贫血，皮下组织水肿等[8]。周群兰等[18]报道了大黄对副溶血性弧菌和鳗弧菌的最低抑菌质量浓度均为1.8 mg/mL，抑菌效果值得关注。

2.2.4 气单胞菌属(Aeromonas)

气单胞菌属细菌也是一类需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌。温和气单胞菌(A.sobria)几乎危害所有的淡水鱼类，引起以败血症、腹泻为主要症状的疾病。何爱华等[10]检测到大黄的抑菌圈直径为(8.1±1.21) mm，最低抑菌质量浓度为8 mg/mL。嗜水气单胞菌(A.hydrophila)是鱼类最常见的致病菌，引起的慢性感染主要为溃疡病，病灶红肿、发炎和出血[10]，引起淡水鱼的细菌性败血症。该病流行地区最广，流行季节最长，危害淡水鱼的种类最多，造成的损失最大，也可以引起两栖类、哺乳类等患病，备受国内外学者重视。研究大黄对嗜水气单胞菌抑制作用的文献也较多。何爱华等[10]检测到的抑菌圈直径为(9.7±0.27) mm，最低抑菌质量浓度为8 mg/mL。而卢春霞等[13]采用更高质量浓度的大黄提取物，检测到的抑菌圈直接为12.97～14.43 mm，最低抑菌质量浓度为0.78～1.56 mg/mL，效果好于何爱华等的报道。其他报道的最低抑菌质量浓度介于0.75～4 mg/mL[12，18，20，22-23]之间，也有未检测到抑菌作用的个例[22]。

2.2.5 爱德华氏菌属(Edwardsiella)

迟钝爱德华氏菌(E.tarda)为兼性厌氧的革兰氏阴性致病菌，严重危害水产动物，已在20多种鱼类中引起了病害，如鳗鲡、牙鲆、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、鲤鱼(Cyprinuscarpio)等，给水产养殖造成了巨大损失；同时也是一种人、鱼共患病原菌，直接威胁人类健康。韩金钢等[25]报道了大黄提取物对迟缓爱德华氏菌的抑制作用，其最低抑菌质量浓度值为3 mg/mL。

2.2.6 链球菌属(Streptococcus)

链球菌是一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性菌，是人类的重要病原之一，也是猪、牛、鱼等其他多种脊椎动物的重要病原菌。目前已有多个国家报道了鱼类链球菌病的爆发与流行，受感染的鱼类包括多种海水和淡水鱼类，以温水性鱼类最为严重[9]。链球菌常引起鱼类中枢神经损坏导致化脓性突眼症及脑膜炎等[8]。海豚链球菌(S.iniae)为革兰氏阳性菌，是有鳍鱼类重要的病原菌，已在全球范围内造成了巨大的经济损失，每年因海豚链球菌病造成的经济损失超过1.5亿美元。陆续也有人类感染的报道。张彬等[16]报道了10种中草药对海豚链球菌的抑制作用，其中大黄的抑菌作用比较突出，抑菌圈直径为(19.00±1.00) mm，仅次于黄连和黄芩。

2.2.7 黄杆菌属(Flavobacterium)

柱状黄杆菌(F.cloumnare)是严格需氧的革兰氏阴性菌，是草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、金鱼(Carassiusauratus)、虹鳟和鳜鱼(Sinipercachuatsi)等烂鳃病的病原菌，也是其他重要经济鱼类如斑点叉尾(Ietaluruspunetaus)、鲑鱼、鲤鱼等柱形病的病原菌，对我国淡水及冷水养殖鱼类的危害极其严重。何爱华等[10]检测到的抑菌圈直径为(9.69±0.31) mm，最低抑菌质量浓度为9 mg/mL。

可见，大黄提取物对于革兰氏阴性、阳性菌均有一定的抑制作用，最低抑菌质量浓度基本在0.1～100 mg/mL数量级上，抗菌作用明显，可以用来治疗水产养殖中相关致病菌引起的疾病。

表1 大黄抗菌作用涉及到的菌种的系统分类学地位

表2 大黄抑制各水产细菌及临床常见菌的抑菌圈直径

注：a.本表未区分各亚种、标准菌株、临床分离菌株等; b.抑菌圈测定方法：*牛津杯法/平皿打孔法；**纸片法.

表3大黄抑制各水产细菌及临床常见菌的最小抑菌质量浓度及最小杀菌质量浓度 mg/mL

注：a.本表未区分各亚种、标准菌株、临床分离菌株等；b.测定方法包括各种常量/微量稀释法，本表不作区分；c.文献作者未明确具体种.

2.3 影响大黄抑菌效果的主要因素

笔者发现各文献报道的结果之间存在一定程度的差异，分析原因可能与试验方法和药物成分两方面因素相关。一方面，药物与生物体内(体表)微生物的作用可能受很多因素影响，体外抗菌法脱离了生物体的内环境，对药物作用的影响因素相对简单很多。虽然实际应用时可能与体外抗菌法测到的抗菌效果有所不同，但是，体外抗菌法仍是进行大规模药物筛选最快速、最主要的方法之一。目前，主要的体外抗菌试验方法包括抑菌圈测定法、最小抑菌质量浓度、最小杀菌质量浓度测定法等，每种测定法还有几种不同的试验方法。虽然各种试验方法的标准越来越趋于统一，但是试验方法细节的改变，都可能影响试验结果。同时，试验中可能采用各个亚种、临床分离的菌种等非标准菌株，在细胞、分子水平的不同均可能影响药物抗菌效果的检测。本文提到的文献就有涉及到各种不同的菌株和试验方法，这可能是试验结论有差别的重要原因。另一方面，最大效率地提取出中药的有效成分，减少提取损失，一直是中药研究的重要问题。从传统的直接打粉入药、水提、醇提、水提醇沉等各种常用方法到超声波提取，二氧化碳超临界提取、超微粉碎等现代提取手段，提取方法千差万别，即便是同样的方法，温度的不同、提取试剂的成分不同等等提取条件的不同，也会改变提取出来的物质成分和含量，进而影响药物的作用效果。本文提到的文献，采用了各种不同的提取方法，有的还采用两种甚至多种不同的提取方法来比较抗菌效果。刘宏伟等[22]比较了不同加工处理中草药对鳗鲡主要致病菌的抗菌效果，结果表明中草药经粉碎方法处理后的体外抑菌效果明显好于水煎煮法。这也可能是试验结论有差别的重要原因。

3 大黄蒽醌的抗菌作用

大黄含有蒽醌类、蒽酮类、二苯乙烯类、苯丁酮类、多糖类、鞣质类等多种有效成分[30]，其中与抗菌效果最相关的是蒽醌类成分，有芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚等。按照天然化合物氧化还原的规律及生源关系，中药大黄中还有大黄醛[31]，具体结构见图1。从结构上看，大黄酚、芦荟大黄素、大黄醛、大黄酸依次为具有甲基、羟甲基、醛基、羧基取代的具有相同母核的蒽醌化合物，氧化程度逐渐增强。宗金锐等[31]认为，其抗菌效果和其结构有明显的构效关系，但不同菌种的构效关系可能不尽相同，包括酸性基团的存在、结构的氧化还原性等均可能影响抗菌效果。

图1 大黄中蒽醌类化合物

注：a.本表未区分各亚种、标准菌株、临床分离菌株等；b.抑菌圈测定方法：牛津杯法/平皿打孔法.

表5 大黄蒽醌抑制各水产致病细菌及临床常见菌的最小抑菌质量浓度及最小杀菌质量浓度 μg/mL

注：a.本表未区分各亚种、标准菌株、临床分离菌株等；b.测定方法包括各种常量/微量稀释法，本表未作区分.

4 含有大黄的复方中药的抗菌作用

多种中药的联合应用，不仅可以通过主要化学成分间的增溶、助溶等物理作用，提高有效成分的溶出率，增强药效；更可以在宏观上调节各药物的药性，提高机体的免疫力等；甚至可能产生新的物质使药性更强，以上均表现为一定的协同作用。含大黄的复方中药已用于治疗水产致病菌引起的疾病。文献报道的和大黄联用起协同效果的药材包括石榴皮、虎杖、五倍子、黄芩等。

5 结论与展望

综上所述，大黄对多种水产致病细菌及临床常见菌均有较好的抑制作用，是“可能部分替代孔雀石绿用于防治水霉病的药物”和“替代硝基呋喃类的药物用于抗菌的药物”之一[36]。随着青蒿素的发现获得诺贝尔奖，传统中药的有效成分的研究必将日益得到重视。有着扎实的临床用药基础，又被现代循证医学所证实有明显效果的大黄，必将成为水产养殖中疾病治疗的利器，在其基础上进一步研究更加有效、环境友好、给药方式合理的中药渔药也必将大有可为。