油茶粕制备复合茶皂素清塘剂产品对鱼和虾毒杀效能的研究

        油茶粕制备复合茶皂素清塘剂产品对鱼和虾毒杀效能的研究

高 晶，马 力，陈隆升，李志钢，陈永忠

(1.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004；2.省部共建木本油料资源利用国家重点实验室，湖南 长沙 410004；3.中国科学院亚热带农业生态研究所，湖南 长沙 410125)

油茶籽经物理压榨或浸出提取后的副产品称为油茶粕，我国平均年产量大概为40～80万t，约为茶油年产量的3倍[1]。茶皂素是指存在于油茶粕中的一种天然糖苷化合物。茶皂素溶于水时，表现出生物活性和表面活性，具有较强的杀菌抑菌作用[2- 3]。此外，茶皂素可与血红细胞细胞壁组成物质胆固醇相结合，形成水溶性分子复合物，造成血红细胞渗透压增大而破裂的溶血现象[4- 5]。但这种毒性对人体无害，而特异性作用于冷血动物，尤其是鱼类。鱼藤酮来自豆科藤本植物——鱼藤的根部，具有杀虫活性，对大约800多种害虫均具有杀虫效果。鱼藤进入害虫体内后，对害虫的生长发育起抑制作用，同时减弱其呼吸作用而使害虫能量供应不足最终死亡。此外，据研究，鱼藤酮对人畜无害且对环境无污染，是一种环保的杀虫剂。三氯异氰脲酸和溴氰菊酯都具有较强的杀菌抑菌能力，不仅对环境和人体安全，而且无致畸和致癌作用。

我国虾蟹养殖业从1978年萌芽开始就经历飞速发展。 到2019年，中国对虾单位面积产量达2.08 t·hm-2。据2020年中国渔业统计年鉴统计，我国南美白对虾养殖产量已占世界对虾养殖总产量的80%以上[6]。然而，在对虾蟹的养殖中常常会遭遇养殖池中固有的鱼类以及野生杂鱼的威胁，造成饲料竞争，甚至威胁幼虾蟹苗和处于蜕壳生长期的对虾，从而严重影响虾蟹的产量，对虾蟹养殖者造成较大的经济损失[7- 8]。目前,我国虾蟹养殖还主要依靠石灰等化学试剂作为清塘剂，大多数存在毒杀无选择性、成本高和不安全等缺点[9]。因此，开发一种低毒、高效、低残留且对环境友好的对虾蟹养殖清塘剂具有较好的应用前景。茶皂素属于三萜类皂角甙，可从油茶粕中提取获得[10]。油茶粕茶皂素对鱼类红细胞具有溶血作用，可以通过破坏鱼鳃的上皮细胞而进入鱼鳃的血管，使细胞膜的通透性增加，导致细胞质外渗与血红细胞解体[11- 12]。而茶皂素对虾蟹无毒性且可促进虾的脱壳和生长。此外，茶皂素可通过自然分解或者微生物迅速降解，是一种理想的环境友好型清塘剂[13]。本文旨在以油茶粕为主要原料，精提主要活性成分茶皂素，寻求高效、高安全性、低成本的新型清塘剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验涉及的雄鱼、鲫鱼、草鱼、基围虾、中国对虾均从农贸市场购得。雄鱼体长10～25 cm，鲫鱼体长10～15 cm，草鱼体长10～25 cm，基围虾体长3～6 cm，中国对虾体长2～5 cm。试验鱼在曝气的自来水中预饲2 d。试验鱼用水族箱大小120 cm×60 cm×60 cm，试验水深40 cm左右；试验虾用水族箱大小90 cm×50 cm×50 cm，试验水深30 cm左右。试验水温为26 ℃，试验用pH值在6.0～7.0之间。

1.2 试验地点

试验地点在国家林业局油茶研究开发中心(于2008年经国家林业局批准，依托湖南省林业科学院而成立的专门从事油茶产业研究与成果转化的平台)内。

1.3 试验设计与方法

1.3.1 茶皂素复合清塘剂的制备 首先，称取55～75 g茶粕用粉碎机粉碎并过筛网，加入100 ml水搅拌，混合均匀并过滤。然后，加入15～25 g鱼藤酮，用涡旋混匀仪(保鲜膜包裹)混合均匀并过滤；加入4～10 g三氯异氰脲酸，用涡旋混匀仪(保鲜膜包裹)混合均匀并过滤；再加入8～15g溴氰菊酯，用涡旋混匀仪(保鲜膜包裹)混合均匀。所得溶液搅拌后抽滤浓缩得到浓缩液，通过喷雾干燥得到清塘剂试验品。

1.3.2 茶皂素复合清塘剂对常见淡水鱼的毒杀计量关系的研究试验 制备茶皂素55%～70%、鱼藤酮15%～25%、三氯异氰脲酸4%～10%、溴氰菊酯8%～15%的复合清塘剂4种(见表1)。每只水族箱放养鲫鱼(A1组)、雄鱼(B1组)和草鱼(C1组)各20条，分别以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1绝对浓度(参考已有报道和本试验所用清塘剂成分)加入复合清塘剂1，同时设空白对照组1(cont1 — 1组)，不加任何药物；另外设置其他品牌清塘剂作为对照组2(cont 2 — A1，其他品牌清塘剂鲫鱼对照组/ cont 2 — B1，其他品牌清塘剂雄鱼对照组/ cont 2 — C1，其他品牌清塘剂草鱼对照组)。试验时采用氧气泵充氧，进行48小时观察记录，试验重复2次。

表1 各茶皂素复合清塘剂成分及其含量百分比Tab.1 Percentage of tea saponin-pond clearing agents com-position and content of tea saponin%茶皂素鱼藤酮三氯异氰脲酸溴氰菊酯复合清塘剂155251010复合清塘剂26020812复合清塘剂36518611复合清塘剂47016410

复合清塘剂2-4试验设计与复合清塘剂1一致。复合清塘剂3试验过程分组如下：鲫鱼(A3组)、雄鱼(B3组)和草鱼(C3组)，空白对照组1(cont 1 — 3组)、其他品牌清塘剂作为对照组2(cont 2 — A3，其他品牌清塘剂鲫鱼对照组/ cont 2 — B3，其他品牌清塘剂雄鱼对照组/ cont 2 — C3，其他品牌清塘剂草鱼对照组)。

1.3.3 茶皂素复合清塘剂对基围虾和中国对虾的毒杀计量关系的研究试验 虾鳃与鱼鳃的结构和成分完全不同，虾鳃的主要成分是几丁质和蛋白质。较低浓度茶皂素对虾几乎不产生毒副作用。因此，本试验选择较大剂量复合茶皂素清塘剂来验证对基围虾和中国对虾的毒杀效能。每只水族箱放养基围虾(D组)和中国对虾(E组)各30尾，分别以10.0、20.0、30.0、40.0 mg·L-1绝对浓度加入复合清塘剂1，同时设空白对照组3(cont 3 — 1组)，不加任何药物；另外设置其他品牌清塘剂作为对照组4(cont 4 — D1，其他品牌清塘剂基围虾对照组/ cont 4 — E1，其他品牌清塘剂中国对虾对照组)。采用氧气泵充氧，进行48小时观察记录，试验重复2次。

复合清塘剂2 — 4试验设计与复合清塘剂1一致。复合清塘剂3试验过程分组如下：基围虾(D3组)和中国对虾(E3组)、空白对照组3(cont 3 — 3组)、其他品牌清塘剂作为对照组4(cont 4 — D3，其他品牌清塘剂基围虾对照组/ cont 4 — E3，其他品牌清塘剂中国对虾对照组)。

2 结果与分析

2.1 相同浓度茶皂素复合清塘剂毒杀效能的研究

2.1.1 相同浓度复合清塘剂1毒杀效能的研究

(1)对鱼类毒杀效能的研究。分别以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1绝对浓度复合清塘剂1处理鲫鱼、雄鱼和草鱼，研究不同浓度复合清塘剂1对鲫鱼、雄鱼和草鱼的毒杀效能(见图1 A-D)。根据结果可知：相同浓度的复合清塘剂1对各试验用鱼的毒杀能力与试验时间成正比；当复合清塘剂1的浓度在1.0～3.5 mg·L-1时，各类鱼存活率依次是鲫鱼<草鱼<雄鱼；与其他品牌清塘剂相比，复合清塘剂1对鲫鱼、雄鱼和草鱼的毒杀效能更高。

图1 相同浓度复合清塘剂1对各类鱼的毒杀效能Fig.1 The same concentration of the composite pond clearing agent 1s′ poisoning effectiveness on various types of fish

(2)对基围虾和中国对虾毒杀效能的研究。分别以10.0、20.0、30.0、40.0 mg·L-1绝对浓度复合清塘剂1处理基围虾和中国对虾，研究不同浓度复合清塘剂1对基围虾和中国对虾的毒杀效能(见图2 A-D)。根据结果可知：跟其他品牌清塘剂相比，复合清塘剂1对基围虾和中国对虾几乎无毒杀能力；复合清塘剂1对基围虾和中国对虾的毒杀能力随着时间的推移并没有增强。

图2 相同浓度复合清塘剂1对虾的毒杀效能Fig.2 The same concentration of the composite pond clearing agent 1s′ poisoning effectiveness on shrimp

2.1.2 相同浓度复合清塘剂2毒杀效能的研究

(1)对鱼类毒杀效能的研究。按照1.3所示试验方法制备复合清塘剂2，同样以 1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1绝对浓度处理鲫鱼、雄鱼和草鱼，结果显示复合清塘剂2对鲫鱼、雄鱼和草鱼的毒杀效能与复合清塘剂1结果类似。

(2)对基围虾和中国对虾毒杀效能的研究。制得复合清塘剂2，选择10.0、20.0、30.0、40.0 mg·L-1绝对浓度处理基围虾和中国对虾，结果显示复合清塘剂2对基围虾和中国对虾的毒杀效能与复合清塘剂1结果类似。

2.1.3 相同浓度复合清塘剂3毒杀效能的研究

(1)对鱼类毒杀效能的研究

分别以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1绝对浓度复合清塘剂3处理鲫鱼、雄鱼和草鱼，研究不同浓度复合清塘剂3对鲫鱼、雄鱼和草鱼的毒杀效能(见图3 A-D)。根据结果可知：相同浓度的复合清塘剂3对各试验用鱼的毒杀能力与试验时间成正比；与其他品牌清塘剂和复合清塘剂3相比，复合清塘剂3对鲫鱼、雄鱼和草鱼的毒杀效能更强；当复合清塘剂3的浓度在1.0～3.5 mg·L-1时，各类鱼存活率依次是鲫鱼<草鱼<雄鱼。

图3 相同浓度复合清塘剂3对各类鱼的毒杀效能Fig.3 The same concentration of the composite pond clearing agents 3s′ poisoning effectiveness on various types of fish

(2)对基围虾和中国对虾毒杀效能的研究。分别以10.0、20.0、30.0、40.0 mg·L-1绝对浓度复合清塘剂3处理基围虾和中国对虾，研究不同浓度复合清塘剂3对基围虾和中国对虾的毒杀效能(见图4 A-D)。根据结果可知：跟其他品牌清塘剂相比，复合清塘剂3对基围虾和中国对虾几乎无毒杀能力；复合清塘剂3对基围虾和中国对虾的毒杀能力随着时间的推移并没有增强。

图4 相同浓度复合清塘剂3对虾的毒杀效能Fig.4 The same concentration of the composite pond clearing agents 3s′ poisoning effectiveness on shrimp

2.1.4 相同浓度复合清塘剂4毒杀效能的研究

(1)对鱼类毒杀效能的研究。同样的试验方法和设计研究复合清塘剂4对鲫鱼、雄鱼和草鱼的毒杀效能，结果显示复合清塘剂4对鲫鱼、雄鱼和草鱼的毒杀效能与复合清塘剂3结果类似。

(2)对基围虾和中国对虾毒杀效能的研究。复合清塘剂4对基围虾和中国对虾的毒杀效能与复合清塘剂3结果类似。

2.2 不同浓度茶皂素复合清塘剂对鱼类毒杀效能的研究

2.2.1 不同浓度复合清塘剂1对鱼类毒杀效能的研究 分别以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1绝对浓度复合清塘剂1处理鲫鱼、雄鱼和草鱼，研究不同浓度复合清塘剂1对鲫鱼草鱼和雄鱼的毒杀效能(见图5 A-C)。根据结果可知：不同浓度的复合清塘剂1对各试验用鱼的毒杀能力随着时间推移而增强；当复合清塘剂1的浓度在1.0～3.5 mg·L-1时，1.5 mg·L-1复合清塘剂1在36 h对各类鱼的毒杀效能最强；当复合清塘剂1的浓度在1.0～3.5 mg·L-1时，2.0 mg·L-1复合清塘剂1在24 h时对各类鱼的毒杀效能最强。

图5 不同浓度复合清塘剂1对各类鱼的毒杀效能Fig.5 The different concentration of the composite pond clearing agents 1s′ poisoning effectiveness on various types of fish

2.2.2 不同浓度复合清塘剂2对鱼类毒杀效能的研究 不同浓度复合清塘剂2处理鲫鱼、雄鱼和草鱼的毒杀效能与复合清塘剂1的毒杀效能类似。

2.2.3 不同浓度复合清塘剂3对鱼类毒杀效能的研究 分别以1.0、1.5、2.0、3.5 mg·L-1绝对浓度复合清塘剂3处理鲫鱼、雄鱼和草鱼，研究不同浓度复合清塘剂3对鲫鱼草鱼和雄鱼的毒杀效能(见图6 A-C)。根据结果可知：不同浓度的复合清塘剂3对各试验用鱼的毒杀能力随着时间推移而增强；不同浓度的复合清塘剂3对各类鱼的毒杀能力相似，当复合清塘剂3的浓度在1.0～3.5 mg·L-1时，1.5 mg·L-1复合清塘剂3在36 h时对各类鱼的毒杀效能最强，2.0 mg·L-1复合清塘剂3在24小时对各类鱼的毒杀效能最强，3.5 mg·L-1复合清塘剂3在8 h对各类鱼的毒杀效能最强。

图 6不同浓度复合清塘剂3对各类鱼的毒杀效能Fig.6 The different concentration of the composite pond clearing agents 3s′ poisoning effectiveness on various types of fish

2.2.4 不同浓度复合清塘剂4对鱼类毒杀效能的研究 结果显示不同浓度复合清塘剂4处理鲫鱼、雄鱼和草鱼的毒杀效能与复合清塘剂3结果类似。

2.3 各复合清塘剂对鱼毒活性持续能力的研究

所有水族箱备水，投入1.5 mg·L-1复合清塘剂1，48 h后每只水族箱放养鲫鱼、雄鱼和草鱼各20条，基围虾和中国对虾各30尾，观察48 h。在试验持续的48 h内，鲫鱼、雄鱼、草鱼、基围虾和中国对虾均无死亡，表明本研究所使用复合清塘剂在投入养殖塘48 h后清塘效能减弱或消失，对塘内鱼和虾类几乎不具有毒性。

3 结论与讨论

茶皂素对虾蟹养殖中固有鱼类存在较强的鱼毒活性。在生产实际中，当清塘剂中茶皂素含量在55%～70%时，当使用浓度达到1.5 mg·L-1时，36 h即可将养殖塘中鲫鱼、雄鱼和草鱼等常见鱼类清理干净，并对基围虾和中国对虾无毒性；当使用浓度达到3.5 mg·L-1时，用药8 h，试验用鱼死亡率可达到100%。此外，虾蟹养殖生产中，使用茶皂素复合清塘剂清塘48 h后，茶皂素复合清塘剂可在自然条件下降解，不影响后续的生产养殖[8，14]。

目前，国内外虾蟹养殖规模逐年扩大，全球对虾养殖产量高达400万t以上，预计将会持续增长，虾蟹养殖业仍是水产养殖业中具有前景和活力的行业[15-16]。然而各类固有鱼和细菌等的存在阻碍了虾蟹养殖的总产量和存活率，造成了较大的经济损失[17]。因此，寻求安全环保、持续性好的清塘剂产品十分关键。本文所述茶皂素复合清塘剂具有制备工艺简单、生产成本低、操作性简单等优点，具有高效、低残留的特点,适用于工业生产，可为现实生产实际中固有鱼类的清除提供理论基础和指导。