青蒿末复方制剂对草鱼鳃上小瓜虫作用的研究

        青蒿末复方制剂对草鱼鳃上小瓜虫作用的研究

章海鑫 付辉云 陈文静 周智勇 黄江峰 饶 毅 余智杰 朱桂根 李左宏

(江西省水产科学研究所，江西 南昌 330039)

小瓜虫分布广，对寄主大小、种类、部位选择性低，发病前期不易察觉，易引起暴发性死亡，而且治疗困难，给水产养殖带来了巨大的损失。目前对于小瓜虫的防治研究主要有物理、化学药物、免疫等方面。虽然在物理方面得到一些结论，但超声波、紫外线、增加水温等方法不适合在大水体中应用，有条件的可以考虑使用紫外线(LARRY J W.，1998)。免疫和化学药物方面的进展缓慢，如发现有一定作用的醋酸亚汞和孔雀石绿都已被禁用(Houghton G.et al，1986)，筛选出的硫酸铜、高锰酸钾、氯化钠、福尔马林、生石灰等有一定疗效的药物，但这些药物大多数对掠食体阶段有一定效果，而对滋养体阶段效果不明显(POST G et al，1983)。免疫学方法则处于起步阶段，而且困难很大，对于小瓜虫疫苗的开发主要停留在活体培养小瓜虫幼虫注射来免疫鱼体，大规模培养活体幼体的方法还不成熟，只是停留在实验阶段，缺乏可行性。

近年很多研究者开始使用中草药来治疗和预防小瓜虫。青蒿末是从菊科植物黄花蒿(Artemisia annuaLinn)的地上部分干燥后制成粉而来，含有有效成分青蒿素(Arteannuin、 Artemisinine、Qinghaosu，QHS)，对人类疟疾具有良好的治疗作用(屠呦呦等，1998；邹樟等，1985；张秋红等，2011)。目前也有零星报道其对多子小瓜虫杀灭研究的报道，但青蒿素在实际生产上成本过高，实际应用不太现实。而直接使用青蒿末杀灭多子小瓜虫的浓度很高(徐先栋等，2012)，使得其在水产实际应用上受限。因此，本实验在已有研究的基础上，利用中药配方技术配成了青蒿末复方制剂，研究其对多子小瓜虫的临床作用，并分析其药理性，以期为其水产实践应用提供用法和理论借鉴。

一、材料与方法

1.实验动物与实验场所

鳃上寄生小瓜虫的草鱼来源于进贤县梅庄，健康草鱼［(80±5)克/尾］来源于江西省水产科学研究所养殖基地。实验用水泥池为8 米2，位于室内养殖大棚内，水泥池均彻底消毒曝晒。

2.药饵和饲料

青蒿末复方制剂为含青蒿末80%的复方中草药制剂。将正常草鱼饲料(江西丙申饲料公司提供，粗蛋白质含量为28%)磨碎，加入青蒿末复方制剂粉末充分混匀，制成含青蒿末复方制剂2.4%的药用饲料，晾干备用。

正常投喂饲料由江西丙申饲料公司提供，为粗蛋白质含量28%的草鱼全价料。

3.仪器与设备

电子天平、小捞网、温度计、显微镜、饲料制备机、解剖镜、培养皿、冰箱、生化培养箱、5毫升离心管、剪刀。

4.实验设计

(1)青蒿末复方制剂对小瓜虫寄生的预防。将显微镜下未发现小瓜虫的草鱼放养在8 米2的水池中，每个水池放10 尾，总共6 个水泥池，保持24小时连续充气，水温控制在(20±2)℃。实验组3 个水池，投喂1 周药饵，每天两次，投喂率为4%。对照组3 个水池投喂1 周正常饲料，每天两次，投喂率为4%。之后向实验组和对照组每池放入3尾感染小瓜虫的草鱼，每天观察各池草鱼感染小瓜虫的数量。

(2)青蒿末复方制剂对鱼体上的小瓜虫的影响。将寄生小瓜虫可摄食的草鱼放入8 米2的水泥池，每池10尾，保持24小时连续充气，水温控制在(20±2)℃。然后取6个水泥池分别投喂药饵(实验组3 个)和常规饲料(对照组3 个)，每天投喂3次，投喂率为4%。每天使用显微镜观察鱼体鳃上小瓜虫的数量，记录每天小瓜虫的减少情况。

寄生小瓜虫草鱼为平均每尾草鱼鳃丝上显微镜下可观察每个视野(10×10)5～8个。

(3)青蒿末复方制剂血清对离体小瓜虫的杀灭作用。选用未寄生小瓜虫的草鱼放入两个6 米2的水泥池，保持24小时连续充气，水温控制在(20±2)℃。将其中一个水泥池投喂药饵，另一个则投喂常规饲料，每天投喂两次，投喂率为4%；投喂10 天后，采用尾静脉取血的方法取血制作血清。从感染小瓜虫的鱼体上分离出小瓜虫，取5个小瓜虫放入含1毫升纯水的干净培养皿中，然后向培养皿中分别加入含有10、20、40、80 微升喂药饵的血清和40、80 微升投喂常规饲料的血清，同时设1个不加血清只有纯水和小瓜虫的对照。将培养皿放入25℃恒温培养箱中，在0.5、1、1.5、3、5小时等时间点观察培养皿中小瓜虫的数量，实验连续重复3次。

(4)投喂青蒿末复方制剂草鱼血清对鳃上小瓜虫的影响。将寄生小瓜虫的草鱼鳃丝剪断，放入培养皿中。选择使用投喂青蒿末饲料鱼的血清滴入鳃丝上(加入40、80 微升)和正常饲料鱼的血清滴入鳃丝上(加入40、80 微升)，放入25℃恒温培养箱中培养。然后观察鳃丝上小瓜虫的活动情况。

5.统计方法

使用Excel记录数据，并做简单分析，所有数据进行正态性检验。

小瓜虫数量统计：每10 尾鱼在显微镜每个视野(10×10)小瓜虫平均个数。

二、结果

1.青蒿末复方制剂对小瓜虫的预防

青蒿末对小瓜虫的预防效果见表1。从表1 可以看，到摄食药饵的草鱼一直都没有发现小瓜虫寄生，而摄食常规饲料的草鱼在放入寄生小瓜虫的草鱼后第1天就发现有小瓜虫寄生，然后每天都有增加。第5天时所有的鱼都寄生有小瓜虫。

表1 青蒿末药饵对小瓜虫的效果

2.青蒿末复方制剂对鱼体小瓜虫的影响(表2)

从表2中可以看到寄生小瓜虫的鱼摄食药饵后鱼体上小瓜虫的数量减少情况，可以发现投喂两天后实验组小瓜虫数量开始减少，到第5天后减少到平均每个视野只有(2±1.1)个。而投喂正常饲料组则没有明显减少，表明青蒿末复方制剂对小瓜虫有一定的治疗作用。

表2 青蒿末对鱼体上小瓜虫的影响

3.摄食青蒿末复方制剂草鱼血清对小瓜虫的杀灭作用(表3)

从表3中可以看到，采集到投喂药饵和正常饲料鱼体的血清对离体的小瓜虫都不具有杀灭作用，而且对照组中没有加任何血清的小瓜虫反而先死。

表3 复方青蒿末制剂投喂后血清对离体小瓜虫的作用 个

4.摄食青蒿末复方制剂草鱼血清对鳃上小瓜虫的影响

通过血清离体杀虫实验发现药饵投喂后鱼体血清并没有杀灭小瓜虫的作用，因此采取直接在鳃片上滴加血清的实验来观察血清对小瓜虫的作用，结果见表4 和图1。从表4 可以看到，投喂药饵鱼体的血清能够将鳃丝上的小瓜虫驱离鳃丝；而投喂正常饲料鱼的血清则不具有这个功能。图1左边显示小瓜虫刚在鳃丝上，右边则已经离开了鳃丝。

表4 青蒿末血清对鳃上小瓜虫影响

图1 滴血清后鳃丝上小瓜虫活动情况

三、讨论

目前，对于小瓜虫的临床治疗研究有很多，而且也提出了很多新的建议和方法，但由于技术、成本等原因的限制，取得的效果都不太理想。因此，目前对于小瓜虫的防治还是集中在药物方面，如倪达书等(1960)筛选出醋酸亚汞对小瓜虫有一定效果，同样有效的还有孔雀石绿，但由于这两种化学药物均被禁止。同时也筛选出硫酸铜、高锰酸钾、氯化钠、福尔马林、生石灰等有一定疗效的药物，但这些药物大多数对掠食体阶段有一定效果，而对滋养体阶段效果不明显。所以目前国内对小瓜虫病治疗的研究主要集中在中草药上，如辣椒、生姜、五倍子、青蒿琥酯等，想从中找出对小瓜虫有效的药物和成分。

本文选取青蒿末作为主要成分的复方制剂，目的在于研究其对小瓜虫的防治作用。青蒿末的药理学性质已有一定的研究基础，而且其对多种人体和动物寄生虫具有一定的疗效。实验中得到投喂青蒿末复方制剂后的草鱼能够抵御小瓜虫的寄生，同时寄生小瓜虫的草鱼鳃部虫体数量也显著减少，可以肯定青蒿末复方制剂在防治小瓜虫方面有一定效果，但青蒿末复方制剂对小瓜虫的具体药理作用还不是很明了。因此笔者设计了血清实验，喂药后的血清并不能杀死小瓜虫，但能够有效地将小瓜虫从鳃部驱离。徐先栋等(2012)研究得到青蒿末水浸液在高浓度条件下对小瓜虫具有一定的杀灭作用，与本实验结果有一定差异，可能原因为实验中投喂药物量少，而青蒿末确实含有一种能够对小瓜虫有害的物质，使得虫体在低浓度条件下不适应、高浓度条件下死亡，但具体原因还有待进一步研究。