论文：中草药及复方对嗜水气单胞菌体外抑菌作用研究

      中草药及复方对嗜水气单胞菌体外抑菌作用研究

陶 莎，张效平，商宝娣，李小义，姚俊杰

( 1.贵州省农业科学院 水产研究所，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 渔业资源与环境研究中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州省特种水产工程技术中心，贵州 贵阳 550025 )

目前，在我国水产养殖鱼类细菌疾病的治疗中，抗生素药品仍为治疗首选，但长期使用易导致病原菌出现耐药性和药物残留问题[4]。中草药含有丰富的生物活性物质和营养成分，既可提高消化酶活性，促进营养物质消化吸收，进而提高水产动物生长性能，又可提高水产动物非特异性免疫功能，增强其抗菌、抗病能力；中草药还具有毒副作用小、无残留等优点[5-7]。笔者采用水煎法获得41种中草药的提取物，测定41种中草药提取物及其复方

对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果，筛选出能有效抑制嗜水气单胞菌的中草药及复方，为养殖斑点叉尾因嗜水气单胞菌感染引起疾病的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

41种中草药为：金银花、夏枯草、石榴皮、大黄、诃子、败酱草、熟地黄、地榆、黄苓、杜仲、黄柏、紫花地丁、大青叶、苏木、枸杞、丹参、柴胡、板蓝根、厚朴、穿心莲、黄连、五倍子、石菖蒲、青皮、连翘、乌梅、高良姜、肉桂、苦参、茯苓、地肤子、牡丹皮、陈皮、蛇床子、姜黄、猪苓、黄芪、藿香、公丁香、小茴香、昆布。均购自本地中药房。

MH营养琼脂、LB营养琼脂、LB营养肉汤为自行配制，96孔板、牛津杯及其他试验耗材购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验菌株液制备

1.2.2 中草药提取物制备

50 g中草药置于1000 mL双蒸水中浸泡1 h后，大火煮沸转小火熬制2 h，三层纱布过滤药液，剩余药渣再加入1000 mL双蒸水浸泡1 h，重复第一次熬制过程，合并两次药液，小火加热浓缩至50 mL，使药液终质量浓度为1 g/mL(即1000 mg/mL)，121 ℃灭菌20 min，置于4 ℃备用。

1.2.3 中草药抑菌圈测定

采取琼脂平板打孔法测定抑菌圈大小。灭菌培养皿中一次性倒入约10 mL灭菌LB液，待底层凝固后，均匀放置4个灭菌的牛津杯，倒入LB营养琼脂10～15 mL，待凝固后，用无菌棉棒蘸取密度为1×107cfu/mL的菌液500 μL，均匀涂抹在牛津杯以外的培养面上，待菌液完全吸收后，用镊子小心取出牛津杯，往孔中加入80 μL制备好的中草药提取物，每个平板中3个平行，第4个孔加入80 μL灭菌水作对照，28 ℃正置培养24 h后取出测量抑菌圈直径。抑菌圈直径(d)评定标准参照文献[1]：d≥20 mm 为极敏(S++)，20 mm>d≥15 mm为高敏(S+)，15 mm>d≥10 mm 为中敏(S)，d<10 mm为低敏(S-)。

1.2.4 最小抑菌质量浓度及最小杀菌质量浓度的测定

最小抑菌质量浓度(MIC)：采用96孔板微量肉汤稀释法测定。无菌条件下，取干净96孔酶标板(12×8)，每孔加入灭菌MH肉汤100 μL。第1～3列第1行加入制备好的中草药提取物100 μL，充分混匀后，逐次倍比稀释至第11列(每孔液体终体积100 μL，最后一列稀释完后吸出100 μL)，使1～11列提取物质量浓度分别为500 mg/mL(2倍稀释)、250 mg/mL(4倍稀释)、125 mg/mL(8倍稀释)、62.5 mg/mL(16倍稀释)、31.25 mg/mL(32倍稀释)、15.63 mg/mL(64倍稀释)、7.81 mg/mL(128倍稀释)、3.91 mg/mL(256倍稀释)、1.95 mg/mL(512倍稀释)、0.98 mg/mL(1024倍稀释)、0.49 mg/mL(2048倍稀释)；1～3行的1～11孔加入稀释过的菌悬液10 μL，第12孔不加入菌液，做阴性对照，第4行的1～11孔不加入菌液，作为对照查看是否生长细菌，第12孔加入100 μL菌液，做阳性对照，一板一药，28 ℃正置培养24 h后，取出观察结果，前3行与第4行透明度相似的质量浓度即为最小抑菌质量浓度。

最小杀菌质量浓度(MBC)：选择高于最小抑菌质量浓度的质量浓度组，用无菌棉棒蘸取孔中的液体，均匀涂于培养皿中，28 ℃倒置培养18 h后取出观察结果，少于5个单菌落试验组的质量浓度即为该药的最小杀菌质量浓度。

1.2.5 药物联用试验

根据上述试验结果得出效果较好的单方中草药，将选出的中草药进行两两联合试验。试验分为两部分：联用药物对抑菌圈的影响和联用药物最小抑菌质量浓度与最小杀菌质量浓度的测定，根据结果综合分析联用效果，为下一步筛选复方中草药提供依据。

联用抑菌圈效果：培养基的制备类似牛津杯打孔培养基，区别是将两个孔之间的距离缩短约5 mm，两孔中分别加入不同的单方中草药提取物A与提取物B各80 μL，其余操作同1.2.3，中草药两两结合，正置培养，28 ℃培养 24 h，观察两抑菌圈交会处，判断其联用效果。联用效果包括协同作用(++)、相加作用(+)、无相关作用(-)和拮抗作用(--)。

联用最小抑菌质量浓度及最小杀菌质量浓度的测定采用棋盘交叉法。将筛选出的抑菌效果较好的单方中草药进行两两联合抑菌试验，以2MIC的质量浓度为初始质量浓度，用灭菌MH营养肉汤进行2倍稀释，配制每种药的质量浓度梯度为：2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC，配制完成的2种单方中草药按照表1进行混合，各加入500 μL，然后在每孔中加入1%红四氮唑溶液5 μL，检验细菌是否生长(红四氮唑检验原理：细菌生长过程伴随着糖类脱氢，红四氮唑与氢结合发生反应，使培养基发红)。联合抑菌试验以部分抑菌指数(FIC)作为判定依据，部分抑菌指数计算方法如下：

表1 棋盘交叉法图示Tab.1 The graphical representation of board cross

FIC≤0.5为协同作用，0.5

1.2.6 复方配制方法

采用正交试验设计中草药复方配制。根据上述试验结果，得出6种抑菌效果较好的单方中草药(石榴皮、诃子、紫花地丁、苏木、黄连、乌梅)，以6种中草药作为6种因素进行复方配制，根据正交表L25(56)设计出25组复方，分别为M-1、M-2、M-3……M-24、M-25，每组的终体积为1000 μL，各因素质量按照表2所示比例进行配制。复方的抑菌圈、最小抑菌质量浓度及最小杀菌质量浓度测定参照1.2.3和1.2.4进行。

表2 中草药复方体积配比Tab.2 Preparation tables of mixed Chinese herbal medicine by volume ratio

2 结 果

2.1 单方中草药体外抑菌结果

41种单方中草药的抑菌圈直径、最小抑菌质量浓度及最小杀菌质量浓度结果见表3。有抑菌圈的中草药有14种，其中诃子、黄柏、苏木、黄连、连翘、乌梅的抑菌圈直径均超过20 mm，抑菌效果为极敏。综合抑菌圈直径、最小抑菌质量浓度及最小杀菌质量浓度结果可知，石榴皮、诃子、紫花地丁、苏木、黄连、乌梅6种单方中草药对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果较好。其中黄连的综合抑菌效果最好，其抑菌圈直径达23 mm，最小抑菌质量浓度为7.81 mg/mL。

表3 单方中草药的体外抑菌结果 mg/mLTab.3 In vitro bacteriostatic results of single Chinese herbal medicine

2.2 药物联合体外抑菌结果

将筛选出的抑菌效果较好的6味单方中草药进行15组两两联合试验，结果显示：15组联合药敏试验中，石榴皮+诃子、石榴皮+苏木等7组表现为协同作用，石榴皮+黄连、石榴皮+乌梅等6组表现为相加作用；石榴皮+黄连及诃子+黄连2组表现为不相关作用(表4)。进行联合抑菌试验时，部分抑菌指数最低为诃子+苏木组的0.31，部分抑菌指数最高为诃子+紫花地丁组的2.06；未拮抗的比例为93.3%，联用效果较好(即部分抑菌指数≤1)的比例为80%，说明筛选出的6种单方中草药具有较好的抑菌作用(表4)。

表4 药物联合的体外抑菌结果Tab.4 In vitro bacteriostatic results of Combined Chinese herbal medicines

2.3 复方中草药体外抑菌结果

按照表2配制成25组复方中草药，对其抑菌圈、最小抑菌质量浓度及最小杀菌质量浓度进行测定，试验结果见表5。抑菌圈表现为极敏的比例为60%、高敏为40%；最小抑菌质量浓度除M-9组为7.81 mg/mL外，其余试验组均稳定在15.63～31.25 mg/mL；最小杀菌质量浓度不超过62.50 mg/mL的比例为84%。综合抑菌圈直径、最小抑菌质量浓度及最小杀菌质量浓度数据，结合联合用药结果可知，M-10复方组的综合效果最好，即V(石榴皮)∶V(诃子)∶V(紫花地丁)∶V(苏木)∶V(黄连)∶V(乌梅)=2∶5∶1∶2∶3∶4，石榴皮、诃子、紫花地丁、苏木、黄连、乌梅使用质量浓度较单一使用各降低了80.24%、70.60%、94.11%、80.24%、82.33%、76.44%。

表5 复方中草药的体外抑菌结果Tab.5 In vitro bacteriostatic results of mixed Chinese herbal medicines

3 讨 论

3.1 单方中草药的体外抑杀效果

近年来，抗生素的滥用导致多重耐药菌株的出现与流行[8]，抗生素在水体中及水产动物体内残留情况也比较严重，不仅对环境造成很大污染，也危害着人类的健康[9]。研究表明，中草药特殊的抗病原微生物机制使其不易产生耐药性，其可通过调动机体内的积极因素来减弱细菌对组织的破坏以及降低细菌毒力等方式发挥抑菌作用[10]。

本试验结果显示，石榴皮、诃子、紫花地丁、苏木、黄连、乌梅6种单方中草药对嗜水气单胞菌的综合体外抑菌效果较好，其中黄连的效果最好，最小抑菌质量浓度为7.81 mg/mL。王洪彬等[1,11-13]研究显示，诃子、紫花地丁、苏木、黄连、乌梅5种单方中草药对嗜水气单胞菌有较好的抑菌效果，与本试验结果相符，说明诃子、紫花地丁、苏木、黄连、乌梅对嗜水气单胞菌的抑菌效果存在一定的普遍性。本试验结果还显示，石榴皮对嗜水气单胞菌具有较好的体外抑杀效果，与夏与晴等[12-14]试验结果一致。王洪彬等[1]研究显示，石榴皮对嗜水气单胞菌的抑菌效果较差，与本试验结果不一致，这可能是由单方中草药提取方法差异所致：王洪彬等[1]的提取方法为对中草药清洗、烘干后粉碎再水煎提取有效成分；而本试验与夏与晴等[12-14]的试验中，并未对中草药进行上述步骤，只是将烘干的中草药直接进行水煎提取。提取工艺条件的不同，中药活性物质溶出就会发生质量变化，并影响抗菌作用，而随着提取方法的改变，不同方法提取的同种单方中草药抑菌效果可能也会改变[15]。

3.2 中草药体外抑菌效果差异

连翘、乌梅、高良姜3种单方中草药体外抑杀结果显示：连翘与乌梅的抑菌圈效果均为极敏(S++)，但连翘的最小抑菌质量浓度为62.50 mg/mL，而乌梅为15.63 mg/mL，仅为连翘质量浓度的1/4；乌梅与高良姜的最小抑菌质量浓度均为15.63 mg/mL，但高良姜的抑菌圈直径为12 mm，仅为乌梅的1/2。这说明不同中草药可能对同一种细菌存在抑杀效果，但药效上有一定差异，可能与细菌抵抗不同药物的抗性机制有关。

还有研究显示：天南星对蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)存在较强的抑制作用，对荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)的抑制作用较弱，对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)及弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)没有抑制作用[12]；黄连、鱼腥草、五味子、艾草等对大肠杆菌(Escherichiacoli)具有较好的抑制作用，而黄芩和连翘则对大肠杆菌抑制效果较差[16]。本试验结果显示，黄连、连翘对嗜水气单胞菌具有较强的抑制作用，说明同种中草药对不同的细菌抑杀效果存在差异。这可能与不同中草药所含有的活性物质不同有关，比如：黄连中含有5.56%～7.25%的小檗碱，还含有黄连碱、甲基黄连碱、掌叶防己碱等生物碱，小檗碱对多种革兰氏阳性及阴性菌均具有抑制作用，所以黄连对嗜水气单胞菌及大肠杆菌均具有抑制作用；连翘中具有连翘酯苷A、连翘酯苷B、连翘苷、连翘素等活性抑菌物质，但不同地区生长的连翘对大肠杆菌的抑制效果存在差别[17]，这可能导致不同的研究中连翘对细菌的抑制效果不同。

3.3 复方中草药体外抑杀效果

通常，中草药具有抑菌作用的成分主要包括有机酸类、生物碱类、黄酮类、萜类、醌类以及其他成分种类[11]，利用不同药物间的协同作用，将两种或两种以上的药物进行配伍，使其共同作用于致病菌，对水产动物整体治疗有良好效果[18]，将抑菌效果不同的中草药组合成具有协同作用的复方制剂可发挥更好的抑菌作用[19]。笔者利用正交试验设计研究6种抑菌效果较好的单方中草药进行复方配伍后的抑菌效果，正交试验设计是获得最佳搭配的方法之一，其原理为综合比较，即在同因素中将相同水平的结果相加，找出每个因素的最好水平，得到最佳搭配。

根据中兽医学理论和中草药药理性质将多种单味中草药组合成复方中草药，可以减小各种药物的毒性，提高药效[20]。本试验结果表明，复方配伍综合抑杀嗜水气单胞菌效果最好的比例为：V(石榴皮)∶V(诃子)∶V(紫花地丁)∶V(苏木)∶V(黄连)∶V(乌梅)=2∶5∶1∶2∶3∶4，各种中草药的使用质量浓度比单方平均降低了80.66%，但综合抑菌效果要优于单方中草药，可能是因为相互之间的配合将中草药的抑菌物质活性提高。

4 结 论

综上所述，石榴皮、诃子、紫花地丁、苏木、黄连、乌梅6种单方中草药对嗜水气单胞菌的综合体外抑菌效果较好。单一中草药抑菌效果比较多变、不稳定，复方中草药比单一中草药整体抑菌效果较好且稳定。复方配伍综合抑杀嗜水气单胞菌效果最好的比例为：V(石榴皮)∶V(诃子)∶V(紫花地丁)∶V(苏木)∶V(黄连)∶V(乌梅)=2∶5∶1∶2∶3∶4。本研究结果可为中草药在斑点叉尾养殖中的细菌病防控提供理论依据。