常用的药敏试验方法与选择药物原则

药物敏感性试验是水产养殖病害防治人员、执业渔医、乡村渔医的一项基本技能，也是指导水产养殖用药的科学而规范性的做法。

离体抗微生物药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibilit Testing,AST），简称为药敏试验或药物敏感性试验，是指在离体条件下，测定药物抑制或杀灭致病微生物能力的试验；即从鲜活的病鱼等水生动物样本中分离出病原菌，并进行试验，测试抗菌、抑菌类药物在体外对病原菌是否敏感，以指导水产养殖动物病害防治过程中药物的选择和使用，验证药物质量，指导药物研发等，并了解常见疾病病原菌对某种药物的耐药性或抗药性变化。

一、常用的药敏试验方法

可用于致病微生物药物敏感性检测的方法较多，常用的有纸片扩散法、液体培养基稀释法、琼脂板稀释法、E—test法和自动化仪器法等。由于致病微生物药敏试验要求比较严格，需要一定的条件才能完成。目前，我国大多数养殖场或渔药销售店缺少完成药敏试验的基本条件。近几年在少数省份水产技术推广系统开展的水产养殖动物试验室较为常用的药物敏感性试验方法有两种：即定性测定的纸片扩散法（disk diffusion test）和定量测定的液体培养基稀释法（dilution test）。

（一）纸片扩散法

纸片扩散法是世界卫生组织（WHO）推荐的全球统一的标准方法，由美国临床实验室标准化委员会（CLSI/NCCLS）出版的抗微生物药物敏感性试验操作方法和判断标准，是国内进行细菌检查时遵循的唯一标准。

原理：该方法是将含有定量抗菌药物的滤纸片（药敏片）贴在已接种了待测致病微生物的琼脂平板表面上，药敏片中所含有的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断扩散到周围区域，在纸片周围形成递减的浓度梯度，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少。在滤纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，而处于抑菌范围外的致病微生物则可以生长，因此，在滤纸片周围形成透明的抑菌圈。不同抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响面呈可能不同，抑菌圈的大小即可反应出测试致病微生物对药的敏感程度，并与该药对细菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关。

由于纸片扩散法具有操作简单、成本低的特点，目前已被多数在实验室和基层单位所采用。目前市场上已有很多生物制剂公司销售的药敏纸片，但部分种类的渔药没有相对应的药敏纸片出售，可以根据需要自行制作。制备方法如下：

1、培养基

生化试验商店有售各种培养基。不同致病微生物有药敏试验可选择不同的培养基，如做嗜水气单胞菌的药敏试验就可以选择BHIA（脑心浸液琼脂）培养基。

2、药敏纸片

可以购买或者自制。

空白纸片的制备：选取较厚的定性滤纸（最好是新华1号定性滤纸），用打孔机制作直径为6.0mm的圆形纸片，按照50张一份，将纸片分装到穴而干燥的青霉素瓶或小西林瓶或玻璃瓶内，用牛皮纸封口，进行高压（15磅、121℃、15～20min）消毒后，放于37℃温箱或烘箱中数天烘干备用。

药敏纸片的制备：（1）根据不同药物敏感纸片的含药量要求，计算出50片药敏纸片需要的药物总含量，方法是：50×每张纸片的含药量。（2）药物总含量除以抗菌药物原液浓度，得出50张纸片需要的抗菌药物原液的总体积，为抗菌药物总量-抗菌药物原液浓度。（3）在无菌条件下，将各抗菌药物原液加入到装有纸片的小玻璃瓶中，用纸密封瓶口。然后置于小玻璃瓶中，在37℃条件下的烘箱中烘烤，烘干。（4）在无菌条件下，取一片烘干后的药敏纸片贴在培养基上，检查是否有细菌污染，并将小玻璃瓶密封，在4℃条件下保存。即向上述含有50片滤纸片的小瓶中加入药液0.25mL，并翻动滤纸片，使各滤纸片充分浸透药液，但不能捣烂滤纸片。同时在瓶口上记录药物名称，放于37℃温箱内过夜，待其干燥后即密封，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处保存。制作好的药敏纸片的有效期一般为3～6个月。

注意事项：药敏纸片的质量一定要标准，这是做好药敏试验的关键。如果药敏纸片参差不齐（制作药敏约工片时，如果选择的滤纸厚薄不一致、或有缺损，就会导致制备的药敏纸片中药物含量不均匀），常常引起抑制菌环不规则，合锋芒毕露敏测试结果不准确。因此，药敏纸片间差异一准确度都要达到标准要求。同时，为了保持药敏纸片中的药物活性，药敏纸片的PH值一般要求中性；同时，将其置于低温条件（-10℃）下保存，避免潮湿。盛药敏纸片的容器自低温处取出时，应置于室温条件下平衡10分钟以上再打开包装容器，避免冷冻凝水而影响药效。

自制药敏纸片还需自行配制抗菌药液。

药物原液的配制：药物原液的配制一般采用蒸馏水或用纯净水进行药物稀释。一般可按商品渔药使用说明书上的配料或饮水浓度。按1.0g药物多少毫升水或配多少毫克饲料进行配制，就相当于配制试验药液所需加蒸馏水或纯净水的毫升数。如10克药物可配制50千克饲料，其换算方法：1克本品加5000毫升蒸馏水进行稀释。此药液即为用于药敏试验的药液。有些药物的溶解性不同，需要使用NaOH溶液或其它溶剂进行溶解，溶剂的选择可以查阅《中国兽药典》技术资料。

3、待测致病微生物

即为待测药敏的致病微生物。需要注意的是，因为不同的致病微生物对同种药物的敏感性有所不同，药敏纸片法测定相同药物对不同种类的致病微生物的抑制效果时，可能会观察到直径大小不同的抑菌圈。如果致微生物不纯，该供试微生物在试验中所产生的抑菌圈与纯培养状态下所产生的抑菌圈大小差异较大，就会影响对药敏试验结果判断的准确性，最终导致难以参考药敏试验结果选择合适的抗菌药物。

一般而言，应避免直接挑取初步分离的菌落做药敏试验，除非在暴发性疾病流行的紧急情况下，当革兰染色提示出分离微生物为单一种类时，可以直接挑取菌落做药敏试验，但是，其结果也仅能作为药敏试验结果的初步报告，随后必须用标准方法重复做药敏试验。

4、实验操作

（1）接种

在超净工作台或无菌室中操作。用经火焰灭菌（酒精灯）接种环挑取适量待测致病微生物，以划线方式将其涂布到已经铺有培养基平皿上。具体操作方法：用灭菌接种环挑取适量致病微生物，分别在培养其平皿的边缘相对应的四点涂菌，以每点开始线涂菌至培养基平皿的1/2。然后，再找到第二点划线至培养其平皿中的1/2，依次划线，直至将致病微生物均匀密布于培养基平皿中。

另外，也可以挑取待测致病微生物与少量生理盐水中，制成致病微生物混悬液，用灭菌棉拭子将待测致病微生物混悬液涂布到平皿培养基表面。要涂布均匀致密，直接法要把菌液浓度用生理盐水或PBS调到0.5个麦氏标准再涂布均匀。

（2）贴药敏片

在无菌条件下，将镊子在酒精灯火焰上灭菌后略停，取药敏片贴到培养基平皿表面。为使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻轻按几下药敏片。为能准确地观察家结果，要求药敏片能有规律地分布于平皿培养基上；一般可在平皿培养基中央贴切1片，外围可等距离贴切若干片（一般可贴7片），每种药敏片所含药物名称要记住。

（3）培养

在涂有致病微生物的培养皿上，药敏片中的抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其药物浓度呈梯度递减。因此，在药敏片周围一定内的致病微生物生长受到抑制。在经过一定时间培养后，可形成1个个抑菌圈。抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大；反之就越小；若无抑菌圈形成，就说明该菌对此供义工 药物具有耐药性。其抑菌圈直径大小与药物浓度直接相关。因此，药敏试验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判断敏感度高低的标准。

药物敏感试验结果判定标准

药敏试验一般采用水解酪蛋白（Mueller_Hinton,M-H）固体或液体培养基。操作方法：将分离到的细菌进一步纯化，扩大培养后用无菌生理盐水清洗制成菌液，在超净工作台中或酒精灯旁用涂布棒将菌液均匀涂在培养皿中的MH培养基表面。15分钟后，用无菌报镊子将药敏感纸片放于固体培养基表面，并轻压，使纸片贴在培养基表面密实不留缝隙。一般每个培养基上贴4～6片，并在整个培养皿中分布均匀，防止出现抑菌圈重叠。再将培养皿置于28℃的培养箱中培养24小时，观察并记录结果。纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对该渔药的敏感性。

自制药敏纸片时，可根据本地区常见渔药的种类灵活选择，通过药敏试验加以筛选到最合适的种类，既可缩短疗程，又可避免盲目用药和滥用药。

5、影响药敏试验结果的主要原因

（1）培养基

致病微生物药敏试验所用的培养基种类较多，一般情况下，采用世界卫生组织（WHO）统一要求的M-H培养基，因为这种培养基中含有的低胸腺嘧啶是与磺胺类药物竞争的物质，因此，进行致病微生物药敏试验的效果较好。此外，这种培养基中还含有适量的Ca、Mg，在培养基中起到蟹酶的作用。但是，有些致病微生物对培养基中的成分有特殊要求，这类特殊的致病微生物就需要用特殊的培养基才能完成药敏试验。例如，流感嗜血杆菌的药敏试验培养基需要用ETM琼脂；淋球菌的药敏试验培养基则需要添加有5.0%羊血的匚克力M-H琼脂。肺炎链球菌的药敏试验用M-H琼脂加5.0%脱纤维羊血培养基。培养基中还有适量的确Ca、Mg，在培养基中起到触酶的作用，其含量的变化可影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞杆菌的试验结果；这些物质的含量过高时，抑菌圈会变小；含量过低时，则抑菌圈就会很大。

致病微生物药敏试验的培养基厚度大约为4.0mm，若厚度大于4.0mm，会使细菌出现耐药；若厚度小于4.0mm，则可能导致耐药性容易出现敏感。所以，试验时决不能把药敏纸片放在中央部位，而应均匀地放在培养皿周围的培养基上。制作药敏试验的培养基用水，主要含有Ca、Mg、Al等矿物质离子，也在很大程度上影响着试验结果。

（2）红敏纸片

药敏纸片的好坏，对药物稳定性和活性有很大影响。加工药敏纸片的滤纸一般是使用加厚型的滤纸，因为这种滤纸杂质少，对药物保存无太大影响。如果使用普通滤纸，被水浸后会呈碱性，并且含有大会量无机离子，对药物有较大影响，所以，一般不建议使用普通滤纸。药敏试验用纸片的PH值一般要求为中性，以适合药物的活性发挥。药敏纸片的厚度要求在1.0mm左右，以有利于细菌的生长和药物的扩散。药敏试验用纸片的直径在6.0～6.35mm之间，因为纸片的厚度和直径大小都会影响药敏试验的结果。

药敏纸片的片间距和质量好坏中做好药敏试验成败的关键。如果是从商店购买的药敏纸片，有可能会出现抑菌环偏小或偏大的问题，纸片之间也会存在较大片间差距。因此，纸片在用前必须检验其片间差和标准度，只有都达到标准要求后才能使用；同时还要注意药敏纸片的保存要求，因为保存中因为受潮等会影响并降低药物活性。

（3）致病微生物

由于各种致病微生物对药物的敏感性不同，产生的抑菌圈大小各异，如果供测试致病微生物不纯，试验中所产生的抑菌圈大小与该菌种在纯培养状态下产生的抑菌圈大小存在较大差异，就会影响测试结果的判定。因此，需要对各种致病微生物提纯后，分别进行不同的药敏试验。药敏试验时，需要将提纯的菌种配制成一定浓度的菌液。WHO制定的标准是要求菌液浓度在1.5亿/mL左右。若菌液浓度过高，该菌会对药物产生耐药；反之，菌液浓度过低，该菌会对所有药物均敏感。最精确的方法是使用分光光度计测定新鲜培养物菌悬液的吸光度，以确定菌液浓度。

药敏试验中要将菌液浓度均匀地涂在培养基上，这样才能使测试结果不会出现较大偏差。涂菌后15分钟才能贴药敏纸片。因为涂菌后，细菌要有一定时间的适应过程，但时间不能太长，否则会使细菌产生耐药。贴药敏纸片时，每取一种药敏纸片必须烧一下镊子口，避免药敏纸片之间相互污染，以提高药敏的准确性。药物杀灭细菌存在一定程度的量比，药敏试验培养基上细菌层越厚则抑菌圈越小，反之则抑菌圈越大。根据一经物抑菌圈的有无或大小，只能判断出该药物对细菌有没有效果，但其敏感性的高低需要通过得科学严谨的实验来确定。药物的敏感程度需要根据敏感试验结果，并结合以上因素综合分析，才能得出科学结论，而片面地根据抑菌圈的大小就做出判断是不准确的。

（4）培养时间

对于水生动物致病微生物的药敏试验而言，一般培养温度和时间分别为28℃条件下培养18～24小时为宜，有些抗菌药物扩散速度较慢，如多粘菌素，可将已放好抗菌药的培养基平皿，先放置在4℃冰箱内2～4小时，使药敏纸片中的抗菌药物预扩散，这样就可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。

（5）试验数据的应用

药敏试验后，应选择高敏感药物进行疾病的治疗，也可以选用两种药物协同治疗，以减少耐药菌株的形成。在选择高敏感性药物时，应考虑药物吸收途径，因为药敏试验是药物直接接触菌种，而在防治水产养殖动物疾病时的用药时，则是必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以，药敏试验测试得到的数据并不是给药剂量，在实际给药时，高敏感药物一定何如配合适宜的给药方法，这样才能达到理想的治疗效果。

（二）液体培养基稀释法

该方法适用于需罐头及兼气性厌氧的快速生长型致病微生物，如肠杆菌科、葡萄球菌属和肠球菌属；嗜血杆菌属、奈瑟菌属、肺炎球菌及其它链球菌等菌株，还适用于厌氧菌、酵母样真菌及支原体等。

1、实验材料

（1）培养基

根据不同致病微生物的药敏试验钶选择适当的培养基，制作成相应的液体培养基。

（2）药物

与药敏纸工片法采用的药物相同，也可以利用原料药进行。

（3）致病微生物

与上述药敏纸片法采用的致病微生物要求相同。

（4）仪器

高压灭菌锅、超净台、接种环、酒精灯、培养箱、移液器、试管、试管架、滴头等。

  2、实验操作

（1）根据每种药物、致病微生物种类和感染部位的不同，选择不同的抗生素浓度稀释范围，用阳离子调节的M-H肉汤以24小时进行倍比稀释抗菌药物。将稀释后的药物加入试管，或加入冷却至45～55℃M-H琼脂培养基中，立即在无菌条件下制作系列药物浓度梯度的药敏试验试管。

（2）致病微生物菌液配制

用无菌生理盐水或M-H肉汤配置成0.5麦氏单位浊度描图 悬液。

（3）接种与培养

在配制好的含药物浓度梯度培养基试管中加入梯度上述供试致病微生物的菌悬液，使其终浓度为105cfu/mL。制备好的药物敏感测试试管旋转于培养温度和时间为28℃条件下，24下小时以上，再观察试验结果。

（4）观察结果

液体培养基稀释法获得的是供试验药物对致病微生物有最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC）和最小1杀菌浓度（minima bactericidal concentration,MBC）。最低抑菌浓度（MIC）的判读即为肉眼观察无致病微生物生长试管中的最低药物浓度，即为该供试药物的最小浓度。最低杀菌尝试（MBC）的判读即为供试药物杀灭99.9%或以上受试致病微生物所需的最低浓度。具体做法是将高于MJC1～3个稀释度的试管中的培养液，转接种至相应的培养基平皿上，在28℃恒温条件下培养18～24小时，与无致病微生物生长的平皿对应的药敏试管中的药物浓度，即判为杀灭99.9%或以上受试致病微生物所需的最低杀菌浓度（MBC）。

定量测定的稀释法（dilution test），主要测定细菌对某药物的最低抑菌浓度，包括肉汤稀释法和琼脂稀释法。通过配制不同浓度药物的MH琼脂平板或MH肉汤培养基，然后接种分离到的细菌，在28℃培养箱中培养24小时后，无细菌生长的最低药物浓度即中最低抑菌浓度。目前，基层水生动物实验室筛选药物时很少使用该方法。

二、选择药物原则

选择药物时应根据药敏试验结果挑选敏感性高，同时价廉、易得、安全的渔药，防止药物滥用，以减少耐药菌，同时还应坚持以下原则：

1、药敏试验结果仅为选择高敏感药物的参考。因为药敏试验是体外测试细菌对药物敏感性，由于水生动物机体及水环境等因素的影响，药物的药敏试验与实际治疗效果不一定完全符合，所以，不同过分依赖药敏试验。如发现疗效不显著及及时换药。

2、通过药敏试验确定的首选药物不是一成不变的。随着药物使用频率的增加，细菌的耐药性可能会增强，对已测药物的敏感性也会发生变化。因此，定期进行药敏试验，以了解当地细菌对抗菌药的敏感情况就显得很有必要。

3、窄谱抗生素能解决的问题就不要用广谱药物，一种抗生素就直到治疗作用时，不要将两种药物联合使用。必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。

4、尽量避免使用近期用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不再使用。

药敏试验结果判定标准