鱼病致病菌药物敏感性的常用测定(上)：纸片琼脂扩散法

抗菌药物敏感性试验（AST）简称药敏试验（或耐药试验），旨在了解病原菌对各种抗生素的敏感（或耐受）程度，以指导药物治疗中合理选用抗生素药物的微生物学试验。某种抗生素如果能以很小的剂量抑制、杀灭致病菌，则称该种致病菌对该抗生素“敏感”。反之，则称为“不敏感”或“耐药”。为了解致病菌对哪种抗生素敏感，以合理用药，减少盲目性，就应该进行对致病生物进行药敏试验。

致病菌的药敏试验大致过程是：从患体的感染部位（病灶）采取含致病菌的标本，接种在适当的培养基上，于一定条件下纯化培养菌株。如果采用纸片琼脂扩散法（K-B法）完成药敏试验，就可将分别沾有一定量各种抗生素的纸片，贴在培养基表面或用不锈钢圈，内放定量抗生素溶液，培养一定时间后观察抑、杀菌结果。由于致病菌对各种抗生素的敏感程度不同，在药物纸片周围便会出现不同大小的抑制致病菌生长而形成的“空圈”，称为抑菌圈。抑菌圈大小与致病菌对各种抗生素的敏感程度成正比关系。因此，可以根据药敏试验结果有针对性地选用抗生素。

对水生动物致病菌的药敏试验结果，不仅可为科学地选择治疗药物提供重要参考，避免渔用药物的滥用或者误用，而且通过监控病原菌的耐药性变迁，还可用于评价研制渔用药物中新药的抗菌谱和抗菌活性等药效学特征。目前，在水生动物疾病防控中滥用抗生素的现象比较普遍，致使抗药致病菌急剧增加，甚至因长期大量使用广谱抗生素，大量杀伤了水生动物体内正常微生物，失去微生物的相互制约作用，从而使一些少见的或一般情况下的非致病菌大量繁殖，引起所谓“二次感染”的情况屡有发生，给药物治疗水生动物感染性疾病造成人为的困难。因此，在水产养殖中提倡对水生动物致病菌进行药敏试验，对于做到精准用药和坚持合理用药是十分重要的。

目前常用的药敏试验方法有：纸片琼脂扩散法（K-B法）、稀释法、E试验、检测细菌耐药性的方法。稀释法又可分为液体稀释法和琼脂稀释法。在人医和兽医方面，检测细菌耐药性的方法还包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检测、耐万古霉素肠球菌（VER）的检测、耐青霉素肺炎链球菌（PRP）的检测、超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的检测和β-内酰胺酶的检测。

对于水生动物致病菌药敏试验主要采用纸片琼脂扩散法（K-B法）和稀释法进行。本文以纸片琼脂扩散法为例作简要介绍，仅供参考。

纸片琼脂扩散法（K-B法）

该方法是将含有定量抗菌药物的药敏片（药敏片），贴在已接种了待测试致病菌的琼脂培养基表面上，药敏片中所含的药物在琼脂培养基中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，在纸片的周围形成药物浓度梯度。导致药敏片周围能抑菌的药物浓度范围内的致病菌不能生长，而处于药物抑菌浓度范围外的致病菌则可以生长。因此，在药敏片周围形成透明的抑菌圈。不同抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂培养基中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小即可以反映测试致病菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试致病菌的MIC相关。

药敏片可以购买或者自制。自制药敏片时，取新华1号定性滤纸，用打孔机将其打成6.0毫米直径的圆形纸片。取圆形纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15～20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使其完全干燥。

接着，向上述含有50片滤纸片的青霉素瓶内加入药液0.25mL，并翻动滤纸片，使各滤纸片充分浸透药液，翻动滤纸片时不能将其捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，待其干燥后即密封，如有条件可真空干燥。切勿让药敏片受潮，置阴暗干燥处保存，制作好的药敏片的有效期一般为3～6个月。

需要注意的是药敏片的质量一定要标准，这是做好药敏试验的关键。如果药敏片质量参差不齐，比如制作药物纸片时，如果选择的滤纸厚薄不一致，或者有缺损，就会导制备的药敏片中药物含量不均匀，常常引起抑制菌环不规则，使药敏结果判断不准确。因此，药敏片间差和准确度都一定要达到标准。同时，为了保持药敏片中的药物活性，药敏片的pH值一般要求为中性；同时将其置放低温条件（-10℃）下保存，避免潮湿。盛装药敏片的容器自低温处取出时，应放置在室温条件下平衡至少10分钟后再打开包装容器，避免冷凝水影响到药效。

抗菌药的稀释剂通常用纯水。一般可按商品药使用说明书上的配制。按1.0g药物需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制试验药液所加纯水的毫升数。如10g药物可配50kg饲料，其换算方法为1g本品加5000mL纯水。此溶液即为用于做药敏试验的药液。

因为不同的致病菌对同种药物的敏感性可能是不相同的，采用药敏片法测定相同药物对不同种类的致病菌的抑菌效果时，可能会观察到直径不同大小的抑菌圈。如果致病菌不纯，该供试致病菌在试验中所产生的抑菌圈，与纯培养状态下菌株所产生的抑菌圈大小差异比较大，就会影响对药敏试验结果判断的准确性，最终导致水生动物执业兽医在疾病治疗中，难以参考药敏试验结果选择到合适的药物。

一般而言，应该避免直接挑取初分离的菌落完成药敏试验，除非在暴发性疾病流行的紧急情况下、当革兰染色提示出分离微生物为单一种类时，可以直接挑取分离菌落做药敏试验。但是，其结果也仅能作为药敏试验结果的初步报告，随后必须用标准方法重复完成药敏试验。

在涂有致病菌的平皿上，药敏片中的抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其药物浓度呈梯度递减。因此，在药敏片周围一定距离内的致病菌生长受到抑制。在经过一定时间培养后，可形成一个抑菌圈（图1）。

(图1 牛津杯法抑、杀菌试验结果)

以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、高10nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4～6支小管。等待5分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。置适当温度条件下培养一定时间，观察结果。

抑菌圈越大，说明该菌对此药物越敏感，反之就敏感性越差，若无抑菌圈形成，就说明该菌对此供试药物具有耐药性。其抑菌圈直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。因此，药敏试验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准（表1）。

(表1 药敏试验结果判定标准)

影响药敏片试验结果的主要因素有很多：

首先，就是培养基。致病菌药敏试验所用的培养基种类较多，在一般情况下，可以参照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）统一要求的水解酪蛋白（Meller-Hinton，M-H）培养基，因为这种培养基中含有的低胸腺嘧啶是与磺胺类药物竞争的物质。因此，进行致病菌药敏试验的效果比较好。此外，这种培养基中还含有适量的Ca、Mg，在培养基中起到触媒的作用。但是，有些致病菌对培养基中的成分有特殊的要求，这类特殊的微生物就需要用特殊的培养基才能完成药敏试验。例如，对于弧菌中的专性嗜盐菌株、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、发光杆菌美人鱼亚种和杀鲑弧菌的药敏试验培养基，最好是采用添加有1.5%NaCl的MHA培养基；柱状黄杆菌、嗜鳃黄杆菌的药敏试验培养基要用经过稀释的MHA培养基（或者采用Cytophaga agar，配方是0.05%（W/V）胰蛋白胨，0.05%酵母膏，0.05%醋酸钠，0.02%牛肉膏，1.0%琼脂，pH7.2～7.4）；而嗜冷黄杆菌的药敏试验培养基要用Cytophaga agar培养基（或者采用TYE agar，配方是0.14%胰蛋白胨，0.04%酵母膏，0.05% MgSO47H2O，0.05%CaCl2H2O，1.0%琼脂，pH7.2）、海豚链球菌的药敏试验培养基要用添加5.0%羊血的MHA。培养基中还有适量的Ca、Mg，在培养基中起到触酶的作用，其含量的变化，可影响氨基糖苷类和四环素对部分致病菌的药敏试验结果，这些物质的含量过高，抑菌圈会变小，含量过低，抑菌圈就会很大。致病菌药敏试验的培养基厚度大约为4mm，若培养基厚度大于4mm，会使细菌出现耐药；若厚度小于4mm，则可能导致本应耐药的容易出现敏感。所以，试验时最好不要把药敏片放在中央部位，而应均匀地排布在平皿周围的培养基上。制作药敏试验的培养基用水中的一些物质，主要是Ca、Mg、A1等矿物质离子，也会在很大程度上影响着药敏试验的结果。

其次，就是药敏片。药敏片材质的好坏，对药物稳定性和活性有很大影响。加工药敏片的滤纸一般是使用加厚型的滤纸，因为这种滤纸杂质少，对药物保存无太大影响。如果使用普通滤纸的话，被水浸润后会呈碱性，并且含有大量无机离子，所以，使用普通滤纸加工的药敏片对药物有较大的影响。药敏片的pH值一般要求为中性，这样才适合保持药物自身的特性。药敏片的厚度要求大约1.0mm，这样才有利于细菌的生长和药物的扩散速度。药敏片的直径在6.00～6.35mm之间，纸片的厚度和直径大小都会影响药敏试验的结果。

药敏片的片间差和质量好坏是决定药敏试验成败的关键。如果是从商店购买的药敏片，就可能会有抑菌环偏大或偏小的问题，纸片之间又存在很大的片间差。因此，纸片在用前必须检验其片间差和准确度，只有都达到标准要求后才能使用。同时要注意药敏片的保存，因为有些种类的药敏片，如青霉素类，在保存中因为受潮湿环境的影响容易降低其药物的活性。

其三，就是致病菌。由于各种致病菌对药物的敏感性不同，产生的抑菌环大小不同，如果供试致病菌不纯，试验中所产生的抑菌环大小与该菌种在纯培养状态下产生的抑菌环大小存在较大的差异，直接影响到判断结果的准确性。因此，需要对各种致病菌提纯后，分别进行不同的药敏试验。药敏试验时，需要将提纯后的菌种配制成一定浓度的菌液。NCCLS制定的标准是要求菌液浓度在1.5亿/mL左右。若菌液浓度过高，该菌会对所有药物产生耐药；反之，菌液浓度过低，该菌会对所有药物均敏感。最精确的方法是使用分光光度计测定新鲜培养物菌悬液的吸光度，确定菌液浓度。

药敏试验中要将菌液均匀地涂在培养基上，使细菌均匀分布，这样才能使试验结果不会出现较大的偏差。涂菌后15分钟才能贴药敏片。由于涂菌后，细菌要有一段时间的适应过程，但是时间不能过长，否则会使细菌产生耐药。贴药敏片时，每取一种药敏片必须烧一下镊子口，避免药敏片之间相互混淆，以提高药敏试验的准确性。药物杀灭细菌存在一定的量比，药敏试验培养基上细菌层越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大。根据一种药物抑菌圈的有无或者大小，只能判断出该药对细菌有没有效果，但是，其敏感性的高低需要通过科学严谨的试验来确定。药物的敏感程度需要根据药敏试验的结果，并结合以上因素做综合分析，才能得出科学的结论，而片面地根据药敏圈的大小来决定敏感与否，结果就会不够准确。

其四，就是培养时间。对于水生动物致病菌一般培养温度和时间为在28℃条件下培养24～48小时为宜，有些抗菌药扩散速度比较慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的培养基平皿，先放置于4℃冰箱内2～4小时，使药敏片中的抗菌药预扩散，然后再放28℃温箱中培养，这样就可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。

(表2 水生动物致病菌药敏试验的常用药物及其稀释液)

最后，药敏试验后，应选择高敏药物用于疾病的治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少耐药菌株的产生。在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为我们药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给水生动物用药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以在实际用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，这样才会达到理想的治疗效果。(未完待续)

致谢作者：孟思妤，孟长明，陈昌福。
备注：西南渔业网对内容略有修改并配图。

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