斑马鱼作为体内筛选工具：确定PARP抑制剂的有效性

摘要：

通过同源重组（HR）进行双链断裂（DSB）的修复对于维持细胞基因组的稳定性至关重要。HR途径的突变增加了乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的风险。PARP抑制剂（PARPi）是专门针对缺乏HR的肿瘤的化合物。新型PARPi一直在开发中，但研究仍集中在体外数据上。需要一种能够：1）提供体内数据，2）在新型PARPi开发过程的早期3）提供快速结果，4）成本低廉的检测方法。在这里，提出了一种结合体内斑马鱼实验来准确量化PARP抑制剂疗效的方法。发现PARPi在斑马鱼中表现出功能性作用，通常与它们的PARP捕获能力相关。此外展示了Olaparib介导的放射增敏在斑马鱼模型中如何保守。该方法可为新型PARPi的开发提供早期的体内数据。此外，使用斑马鱼可以进行联合疗法的高通量试验，以寻找新的治疗策略。

关键词：

斑马鱼  PARP抑制剂  同源重组  辐照

简介：

细胞中的DNA不断受到内源性或外源性来源的破坏。尤其是DNA双链断裂（DSBs）是有毒的，因为不能修复这种损伤会导致染色体断裂、重排、缺失、细胞死亡甚至癌症。要修复DSBs，有两种主要途径，经典的非同源末端连接（c-NHEJ）和同源重组（HR）。c-NHEJ用最少的末端处理重新连接断裂的DNA末端，这可能导致小的插入或缺失。相比之下，HR需要对断裂进行广泛的末端切除，并使用未损坏的姐妹染色单体作为模板进行无误修复。维持这些通路的完整性对于维持体内平衡至关重要。HR通路的关键基因是BRCA1和BRCA2。种系BRCA1 / 2突变的杂合子携带者显著提高了乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌和胰腺癌的风险。这些癌症是由体细胞中第二等位基因失活引起的，导致HR缺陷，基因组不稳定，最终导致肿瘤发生。

聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）是一组参与DNA损伤修复的蛋白质。已经描述了几种PARP蛋白，其中PARP1在单链断裂（SSB）修复中特别重要。单链断裂后，PARP1以称为“ PARylation”的过程结合DNA并合成Poly ADP-核糖链。该过程募集了与SSB修复有关的其他蛋白质，在这些蛋白质的作用下，修复了损伤并维持了细胞活力。PARP抑制剂（PARPi）是一类通过抑制PARP的催化活性或将PARP捕获到受损DNA上而起作用的一类化合物。结果，防止了SSB的修复。在复制单元中，这些未修复的SSB导致复制叉崩溃，并转换为单端DSBs。由于这些断裂的结构，它们不适合通过c-NHEJ进行修复。相反，用HR来修复单端DSB并重新启动复制叉。在缺乏功能性HR的细胞中（与BRCA1 / 2相关的肿瘤就是这种情况），这些未重新启动的复制叉无法分解，DSB积聚，细胞毒性随之产生。因此，抑制PARP会导致HR缺陷细胞的细胞死亡，而具有HR能力的细胞则可以适当修复损伤。通过消耗两条途径（在这种情况下为SSB修复和HR）有选择地杀死细胞的原理称为“合成杀伤力”。目前正在临床应用一些PARPi，来治疗伴有HR相关缺陷的多种癌症。新型PARPi正在不断开发中，目的是发现具有更高PARP-1选择性且副作用更少的更有效的药物。建立PARPi功效的大多数临床前工作都依赖于体外测定，仅在后期验证中使用小鼠异种移植进行体内验证。虽然小鼠异种移植模型对于建立PARPi的疗效至关重要，但是它们昂贵，耗时，因此只能在PARPi验证过程的后期使用。因此需要一种能够：1）提供体内数据，2）在PARPi开发过程中的早期，3）提供快速结果和4）成本低廉的检测方法。

斑马鱼由于其低饲养成本、初始光学透明性和易于进行基因改造而越来越多地用于癌症研究。斑马鱼目前正在成为研究DNA损伤和修复的重要模型生物。人类和斑马鱼之间有几个途径是非常保守的，如核苷酸切除修复、碱基切除修复、c-NHEJ和HR。我们的小组以前研究发现，斑马鱼的HR途径可以通过Rad51 foci的免疫荧光染色来可视化和量化，Rad51 foci在HR修复过程中与Brca2形成复合物。在本文中，我们证明了brca2-/-突变斑马鱼对PARPi处理的敏感性。这种敏感性可用作新PARPi的初始筛选工具。此外，我们描述了Rad51foci测定法如何准确定量斑马鱼中PARPi的功效。通过测量由应用PARPi引起的复制叉重新启动期间形成的Rad51 foci的数量，可以量化该功效。Rad51 foci的形成与PARPi暴露和活性明确相关。最后，我们演示了斑马鱼如何与其他疗法结合用于测试PARPi的功效。

结果：

眼睛大小测试揭示PARPi对brca2-/-突变体的毒性：缺乏HR的癌细胞长期暴露于PARPi会导致DNA损伤积累和细胞死亡。为评估HR缺乏斑马鱼的这种毒性，将brca2+/-鱼杂交，并在受精后6小时（hpf）将后代暴露于不同浓度的Olaparib。在72hpf时，用5µM或10µM Olaparib处理过的brca2 + / +和brca2 +/-幼虫看起来正常，而brca2-/-突变体显示出严重的发育畸形（小眼睛，弯曲的尾巴，后脑浮肿，图1A）。作为定量标记，我们对幼虫进行了横向定位，并测量了它们的眼睛大小。未经处理的brca2-/-突变体的眼睛大小与野生型没有统计学差异。然而，在用5和10µM Olaparib处理后，brca2-/-突变体的眼睛明显小于野生型，表明其具有合成致死毒性。在更高浓度（20µM）下，我们观察到所有组的严重毒性。我们还对Talazoparib，Niraparib和Veliparib进行了这个实验。观察到Talazoparib的眼睛大小从0.5µM开始减小。而Niraparib的眼睛大小从则从5µM开始减小（图1D）。对于Veliparib，我们只能在非常高的剂量下观察到眼睛大小的微小变化。

图1、brca2-/-突变体幼虫对Olaparib治疗敏感。A） 在6hpf下，将brca2+/-胚胎的杂交体暴露在5µM的Olaparib中，在52hpf时更换Olaparib。在72hpf时，对brca2+/+和brca2-/-幼虫进行了形态学比较。brca2-/-幼虫眼睛较小，尾巴弯曲，后脑水肿（黑色箭头）。B-E）暴露于不同剂量的Olaparib（B），Talazoparib（C），Niraparib（D）和Veliparib（E）的brca2胚胎中眼睛的相对大小。在72hpf时，对基因型之间的眼睛大小进行量化（眼睛大小测试）。数据标准化为未经处理的brca2+/+幼虫。每种情况至少包括3只幼虫。

吖啶橙检测显示PARPi处理的斑马鱼brca2-/-突变株的细胞死亡增加：为了直接观察PARPi对胚胎细胞死亡的影响，我们进行了吖啶橙试验。简而言之，将brca2 +/-鱼杂交，将6hpf的胚胎暴露于几种浓度的Olaparib中。在24hpf条件下，用吖啶橙法观察细胞死亡情况。二甲基亚砜处理的brca2-/-胚胎没有表现出比野生型更多的凋亡细胞。然而，与野生型相比，用1µM Olaparib处理可导致brca2-/-胚胎中的凋亡细胞增加约3倍。在2µM处，细胞死亡甚至更高，突变体的凋亡细胞数是对照组的7.5倍。在较大剂量下，brca2 + / +和brca2 +/-胚胎的细胞死亡水平也升高。我们还对Talazoparib，Niraparib和Veliparib进行了吖啶橙分析。对于Talazoparib，brca2-/-特异性细胞死亡发生在0.5μM，但是在0.75μM时，brca2 + / +和brca2 +/-胚胎也都发生了损伤。

图2、用Olaparib（A），Talazoparib（B），Niraparib（C）和Veliparib（D）处理的brca2cmg35胚胎的吖啶橙分析。在每种情况下至少包含3个胚胎。这表明Talazoparib在合成致死性和一般毒性之间的剂量范围非常狭窄。Niraparib在5µM在5μM处表现出最佳的合成致死效应。尽管使用了非常高的浓度，Veliparib并未显示出任何增加的brca2-/-特异性细胞死亡。总之，斑马鱼的brca2-/-突变体在PARPi暴露后会发生细胞死亡。

Rad51foci检测证明Olaparib诱导DSB后HR途径上调：以前的研究表明brca2-/-突变体对PARPi治疗敏感。接下来，想评估PARPi诱导的细胞死亡是否是由正在进行细胞分裂的斑马鱼细胞中DSBs的上调引起的。为此，我们将72hpf Tg（EF1a：mCherry-zGem）oki011胚胎暴露于不同浓度的Olaparib中7小时，然后进行γH2AX foci测定。该分析可以显示在细胞周期晚期S/G2期复制叉重启期间形成的DSBs。我们专注于72hpf幼虫的大肠细胞，因为这个组织在这个时间点增殖性很强。尽管用DMSO处理的胚胎仅表现出少量的γH2AX foci，但在用Olaparib处理的幼虫中其明显上调。主要在Geminin阳性细胞中观察到γH2AX foci。得出的结论是，Olapaparib在分裂细胞中诱导DSB。接下来，我们调查了是否可以通过HR途径修复Olaparib诱导的DSB。Tg（EF1a:mCherry-zGem）oki011胚胎具有很高的HR，因此可以使用Rad51 foci分析来量化HR的数量。虽然用DMSO处理的幼虫细胞未显示Rad51 foci（图3A），但暴露于Olaparib的幼虫在Geminin阳性细胞中显示出Rad51 foci数量增加。对不同浓度的分析显示出明显的剂量依赖性反应，使用400µM Olaparib可发现最大数量的Rad51 foci。随后调查了HR缺陷型brca2-/-幼虫在PARPi治疗中Rad51 foci的水平。不出所料，虽然brca2 + / +和brca2 +/-胚胎均显示Rad51 foci的上调水平，但brca2-/-突变体几乎未显示Rad51 foci，表明这些鱼中的DSB不能正确修复。总之，暴露于Olaparib会导致DSB的产生，随后通过HR对其进行修复。

图3. PARPi处理可诱导HR途径良好的幼虫产生Rad51 foci。蓝色：DAPI，红色：Geminin，绿色：Rad51。（B）暴露于400μMOlaparib的幼虫切片。（C）Olaparib的剂量反应曲线。每个条件至少包括3个幼虫。（D）将杂交的brca2 +/- 72hpf幼虫暴露于400μM中7小时，然后进行Rad51 foci测定。将处理过的brca2 + / +幼虫的数据标准化。每个条件至少包括3个幼虫。（E） 72hpf-Tg（EF1a:mCherry-zGem）oki011幼虫用于比较Olaparib、Talazoparib、Niraparib和Veliparib在400µM暴露（300µM Talazoparib）和5µM暴露。每种条件至少包括4只幼虫。

Rad51foci分析揭示了PARPi在通过HR诱导修复中的差异：由于PARPi抑制或捕获PARP的能力不同，因此我们假设可以通过评估发生的HR修复量在斑马鱼中捕获这些差异。在斑马鱼中评估了相同的四种临床可用的PARPi（Olaparib, Niraparib, Veliparib, 和Talazoparib）及其诱导Rad51 foci的能力。为此，将72hpf Tg（EF1a：mCherry-zGem）oki011幼虫暴露于400μM的每种PARPi中，因为该剂量显示了olaparib的最大作用（由于溶解度问题，对于Talazoparib仅使用300μM）。随后，鱼在暴露7小时后被固定。与二甲基亚砜对照组相比，Olaparib, Niraparib, Veliparib, 和Talazoparib处理的Rad51foci增加了15倍。相比之下，Veliparib只诱导了4倍多的Rad51foci。这很可能反映了它作为PARP的较弱捕捉者的地位。Talazoparib被认为是最有效的PARPi之一。为了确认这种效力在我们的体内斑马鱼模型中是保守的，我们将Olaparib，Talazoparib和Niraparib的剂量降至5µM，并评估了Rad51 foci的数量。在这个剂量下，Olaparib, Niraparib仅显示Rad51 foci的适度增加。相反，Talazoparib仍显示出明显更多的foci。总之，斑马鱼的Rad51病灶分析可以用来研究PARPi的疗效。

斑马鱼是评价PARPi联合放射效果的理想模式生物：除了PARPi单一疗法外，将PARPi与其他治疗相结合的最终目标是增加对肿瘤组织的细胞毒性。在这项研究中，我们调查了Olaparib的放射增敏作用。为此，收集了杂交的brca2 +/-胚胎，并在6hpf时与400µM Olaparib脉冲，5 Gy IR，Olapaparib和IR的组合或DMSO对照孵育。在24hpf时观察胚胎，应用吖啶橙法。所有接受Olaparib脉冲的胚胎看起来都很正常，但是吖啶橙分析确实显示brca2-/-胚胎的凋亡细胞比野生型增加了2.5倍。所有接受5 Gy照射（IR）的胚胎显示大脑轻微的不透明。吖啶橙分析显示，与未放射对照组相比，凋亡细胞显著增加，与brca2基因型无关。另一方面，Olaparib脉冲和IR联合应用可导致严重的形态学畸形。在这种情况下，由于损伤太严重而不能应用吖啶橙法。数据表明，Olaparib对斑马鱼的放射增敏作用不依赖于brca2等位基因的存在。综上所述，我们的研究表明，斑马鱼可以用来测试PARPi与放射联合的疗效。

图4、Olaparib可使斑马鱼放射增敏。（A） 将brca2+/-6hpf杂交胚胎暴露于400µM Olabarib中30 分钟。在24小时时，应用吖啶橙测定法。每个条件至少包括6个胚胎。（B）用5 -Gy放射杂交的brca2 +/- 6hpf胚胎。在24hpf下进行吖啶橙测定。每个条件至少包括5个胚胎。（C）Olaparib脉冲，放射、Olaparib和放射组合后的24hpf胚胎的图像。Olaparib脉冲不引起视觉形态畸形。5 Gy IR单一疗法会导致大脑轻微不透明（蓝色箭头）。Olaparib结合IR会导致严重的形态畸形，例如眼球缩小，大脑变小和尾巴弯曲（黑色箭头）。

结论：

我们开发了一种体内工具来准确预测PARP抑制剂在斑马鱼体内的有效性。禁用HR后，斑马鱼对PARPi表现出细胞毒性。如Rad51 foci形成所示，在PARPi存在下，HR途径上调。诸如PARPi放射增敏的组合疗法可在斑马鱼中复制。我们的实验结果可能有助于新型PARPi的进一步开发，提供早期的体内数据。此外，斑马鱼幼虫的使用为联合疗法的快速和高通量测试为寻求新颖的治疗策略打开了大门。

原文出自：Zebrafish as an in vivo screening tool to establish PARP inhibitor efficacy - ScienceDirect（李晓菲 译）