水霉及水霉病防治的研究进展

20 世纪60 年代， 我国学者曾将水霉划入藻状菌纲、水霉目、水霉科。随着研究的深入， 许多研究者采用Ainsw orth 等真菌分类系统， 摒弃旧系统中藻状菌分类说法， 将水霉分在真菌界、鞭毛菌门、卵菌纲、水霉目、水霉科。但随着对卵菌纲生物的形态学、细胞学、生理学和分子生物学等方面的深入研究， 结果表明卵菌生活史的核循环、超微结构、细胞壁成分、DNA 的GC百分比、赖氨酸生物合成途径、色氨酸合成酶沉降图型、25S rRNA 分子量等多方面性状与其他真菌都迥然不同， 尽管在功能上与真菌相似， 实际上与真菌无近缘关系。此外， 分子系统发育学研究也显示出卵菌纲不在真菌单元论起源的进化路线上， 因此， 部分学者提出将卵菌纲从真菌界中独立出来成为一个门， 与原来也作为真菌的丝壶菌门和网黏菌门一起被包括在茸鞭生物界中。因而，水霉被描述为具有一些真菌特征， 但非真菌的类真菌生物。

对于水霉的鉴定， 传统分类方法主要是基于菌丝形态、新孢子囊产生方式、游动孢子释放方式等， 而属内具体种类的鉴定则需要基于有性繁殖器官的准确描述， 包括卵原细胞、雄器及卵孢子分化位置及数目等。然而许多从动物体上分离的菌株往往没有有性结构， 或这些结构形成需要较长时间的发育， 或卵原细胞未成熟， 因而用形态学方法难以准确鉴定取自鱼体的水霉菌株， 确定水霉属的具体种类还需寻找其他的方法， 比如DNA 指纹技术， 运用该方法鉴定了从鲑鱼鱼体上分离得到的水霉菌; 扩增多态性DNA 技术， 应用该技术分析从鳟鱼病灶分离的水霉菌株，发现这些菌株之间有85% ~ 100% 遗传相似性， 可能属于同一进化分支， 而与 Saprolegnia diclina parasitica 仅有20% ~ 45% 的遗传相似性， 此外， Bangy eekhun 等研究沟鲶水霉病病原特征， 利用RAPD 方法将分离得到的水霉菌株分为3 个不同组别; 核糖体rDNA 内部转录间隔区 ( Inter nal Tr anscribed Spacer， ITS) 序列分析法， 由于ITS 区域是中度保守区域， 其保守性基本上表现为种内相对一致， 种间差异比较明显， 且具有片段小， 易分析等优点， 能够实质性反映出属间、种间及菌株间的碱基对差异， 因而， 真菌分类学家越来越倾向利用ITS 序列分析技术作为水霉种间分析和种内鉴定的分子标记。Ke等通过分析比较分离自斑马鱼和异育银鲫的2株水霉内部转录间隔区 ( ITS) ， 包括5. 8 S rDNA，确定了2 株水霉同属于S. f er ax 的进化支; 而通过将患病黄颡鱼病灶处分离的水霉菌株 ( HSY) ITS 区序列( 包括5. 8S rDNA ) 与S. litoralis、S. bulbosa、S. oliviae、 S.longicaulis、S . ferax 、S. mixta 和S . anomalies的ITS 区序列( 包括 5. 8S rDNA ) 比较分析， 将HSY 菌株暂定为S. ferax。Hulvey 等分析56 个菌株ITS 区序列和28S rRNA 基因序列， 确定这些菌株分属于10 个水霉物种分支。因此， 在水霉分类鉴定过程中， 应以形态为基础， 生理、生化、生态和分子等手段为辅进行系统分类。

2 水霉生活史及其培养

2. 1 水霉的形态及生活史

水霉的菌丝为管形， 内菌丝发达， 纤细而分枝繁多; 外菌丝中等粗壮， 无分隔。菌丝壁主要由葡聚糖组成，也含有纤维素和少量几丁质。在适当环境条件下， 水霉菌丝发育为动孢子囊， 动孢子囊内形成游动孢子， 游动孢子逸出方式因不同属而异， 在水霉属中， 动孢子囊顶端形成小孔，具有两根顶生鞭毛的梨形孢子( 第一型游动孢子) 逸出， 经过短期游动后，进入静止期， 而后在静体上形成一个具有两根侧生鞭毛的肾形孢子( 第二型游动孢子) ，再经过短时间游动后就休止， 休止孢子萌发成芽管， 芽管发育成新的菌丝。然而当外菌丝处于不良环境条件时， 会形成一窜念珠状的芽孢，这些芽孢一遇到适宜环境， 就可萌发成菌丝或形成动孢子囊。新孢子囊的再生方式有两种， 一种是从空孢子囊中继续长出一个新孢子囊， 另一种是从空孢子囊基部侧生出一个新孢子囊。

水霉的无性繁殖主要借助梨形和肾形两种形态截然不同的双鞭毛游动孢子。游动孢子在生活史中的作用是进行短距离游动，以找到潜在基质和寄主， 最后形成芽管以产生新的菌丝。水霉的有性繁殖则是通过异性配子囊配合方式发生， 当条件有利于有性生殖时， 营养菌丝上便形成较大的球状藏卵器和较小的菌丝状雄器。藏卵器球形或梨形，多数顶生， 少数侧生。藏卵器具有雄性器官， 雄器短而粗与藏卵器同枝， 包括同体和同枝， 少数异枝。减数分裂则在配子囊内发生， 雄器通过受精管穿过藏卵器壁到达卵球，进行质配和核配。受精后形成卵孢子， 卵孢子分化呈中央型或亚中央型， 每个藏卵器3~ 25 个卵孢子不等， 卵孢子由藏卵器壁的分解而释出，经过3~ 4 个月休眠后萌发产生具有短柄的动孢子囊或菌丝， 完成整个生活史。

2. 2 水霉的实验室培养

典型诱导水霉的方法是在池塘或养殖鱼场取水样，加入油菜籽、玉米粒等种子作诱饵， 诱导水霉生长， 并进行分离纯化逐步得到纯培养物。水霉易于分离和培养， 不过因为不易和细菌分开， 纯培养较为困难。目前水霉纯培养多采用连续多次把诱出的菌丝体移入无菌水中的方法，此法易受腐霉 ( Fythium spp. ) 、浮游生物和镰刀菌( Fusariumspp. ) 的污染， 纯化较为困难， 而先从水样中诱出水霉菌或从患水霉病鱼病灶处获得水霉菌， 再用单孢子分离法将水霉菌分离到玉米粉琼脂培养基上培养，能够避免以上因素的影响， 是较为理想的纯培养方法。为了防止纯培养过程中水霉菌受污染， 通常会选择在玉米粉琼脂培养基中加入一定浓度的硫酸链霉素。在实验室纯培养过程中，菌丝及无性繁殖的适宜温度约为25℃ ; 当温度低于25℃时， 温度越低，诱发水霉所需时间越长， 菌丝越短、直径越小， 动孢子囊直径越小， 游动孢子数目越少;当温度高于25℃时， 延长了诱发时间并抑制了菌丝及动孢子囊的生长。当温度为15~ 17 ℃时， 水霉能很快进入有性生殖阶段， 而温度超过20℃时则不能诱导有性生殖。

3 􀀁水霉病病原研究

水霉病给水产养殖业造成巨大经济损失，国内外水产养殖场都有发生水霉病的报道。水霉是引起鱼类发生水霉病的主要病原， 其适应温度范围广， 分布范围亦很广， 一年四季都可以引起鱼类发病。早在17 世纪80 年代就有许多科学家研究鱼类水霉病。然而， 查明病原体往往比较困难， 尤其对于取自鱼体病灶和被感染鱼卵的菌株，因为分离得到的种类在体外培养过程中往往不能产生有性结构。国外学者通过研究鳟鱼、鲤鱼等鱼的水霉病， 认为水霉病的病原体为 S. torulosa、S. ferax、S. monoica 及Achlya nowickii 等。随后Coker将从患水霉病鱼及鱼卵分离得到的菌株命名为S. parasitica。国内学者通过研究施氏鲟水霉病， 根据形态及生理学特征将施氏鲟水霉病原鉴定为 S . parasitica， 并提出孢子表面毛纹饰的不同形态有助于孢子黏附到鱼体表， 进而引发鱼体发生水霉感染的观点。李爱华等初步研究花鲈水霉病， 根据菌丝形态及动孢子囊特征认为病原为水霉属种类， 由于未能观察到或培养出有性生殖器官而尚未确定具体种类，并提出水霉感染发生是在细菌和病毒感染后的继发感染。Jo hnso n 等提出水霉包括17 属， 122种。但是， 对养殖鱼类危害较大的常见种类不多，主要有S . ferax 、 S. monoica、S. diclina、S. parasitica 等。

水霉对宿主无严格的选择性， 在水生动物的各个生长阶段均有发生， 主要寄生在鱼体伤口和死卵上， 危害养殖鱼类和降低鱼卵孵化率。除鱼卵外， 鱼类水霉病均非原发性疾病， 而是继发性疾病。当鱼类皮肤或鳃受到机械损伤及其他病原体的伤害时， 鱼体抵抗力降低， 水霉孢子在伤口处萌发并开始寄生。Bly 等通过研究沟鲶水霉病表明， 只有当鲶鱼免疫力迅速下降才会被水霉菌感染， 而健康鱼体不会感染水霉。

4 􀀁水霉病药物防治研究

4. 1 􀀁化学药物防治

水霉病是困扰水产养殖业的重要疾病， 一直以来主要用化学药物治疗。Foster 等首次应用孔雀石绿预防鱼卵水霉病， Arasaki 等证实了该药物的效果， 并指出0. 02 mg/ L 能够抑制菌丝的生长， 且0. 2 mg/ L 能够抑制动孢子囊和厚垣孢子的萌发。自20 世纪30 年代， 由于孔雀石绿操作方便、价格低廉和效果明显， 因而被广泛使用在水产养殖上。此外， 研究表明， 甲醛在18. 8 mg / L质量浓度下即对水霉孢子表现出明显的抑制作用，在24 mg/ L 质量浓度下浸泡2 h 以上对水霉菌丝开始有杀灭作用， 而Gieseker 等发现用37mg / L 甲醛质量浓度药浴感染水霉病的虹鳟， 其死亡率最低， 约为29% 。含有效碘质量浓度为1 mg / L 的碘伏对水霉的杀菌率超过99%。由于水霉绝大多数存在于淡水中，较高的盐分限制了水霉的分布， 因而食盐也成为治疗水霉病的常见化学药物之一， 当NaCl 质量分数为1%、2 % 时， 水霉生长被显著抑制， 而NaCl 质量分数大于3%时， 水霉则完全不能生长。

尽管孔雀石绿能较好杀灭水霉菌， 但是研究发现， 孔雀石绿能在鱼体内长时间残留， 并可通过食物链对哺乳动物和人类产生致畸、致癌、致突变等作用; 甲醛具有辛辣强烈刺激性， 并且对人体还有致突变和致癌等危害作用; 而碘伏对哺乳动物细胞也有一定潜在的毒性， 长期应用碘或碘化物也可引发一系列中毒症状。此外， 这些化学药品的长期使用会污染水环境。因此， 传统化学药物的危害已引起人们的高度重视， 一些国家已禁止在食用鱼类养殖过程中使用孔雀石绿和甲醛。近年来国际上一些研究者已开始研究开发新型有效药物，如腐殖酸、二氧化氯、氢过氧化物、溴硝丙二醇等， 其杀虫、杀菌效果与孔雀石绿相当， 但其安全性能还有待进一步确认， 而且这些药物并非是防治鱼类水霉病的最佳选择。目前， 英国研制了一种防治水生动物真菌感染的药物Pyceze， 其主要活性成分是“bronopol”􀀁， 可用于处理鱼体及鱼卵， 能够安全有效地防治真菌感染。

4. 2 􀀁生物防治研究

目前发现一些细菌对水产动物病原菌有拮抗作用。因此， 利用生物拮抗作用控制水产动物病害的生物防治也日益受到重视。研究表明， 从患水霉病鱼体的损伤处分离出假单胞菌属和气单胞菌属的细菌， 均能抑制水霉的生长， Lategan 等利用中间气单胞菌A199 能够有效治疗人工感染水霉的澳洲鳗鲡及自发感染水霉的澳洲银鲈。此外， 从发生过水霉病害的养殖水体中分离筛选出的黏质沙雷氏菌对水霉菌丝和孢子均有较强抑制作用， 黏质沙雷氏菌抑制真菌生长的机制在于其能产生几丁质酶， 分解真菌孢子及营养体中的几丁质成分， 从而可以破坏真菌结构。

近年来， 由多种微生物复合而成的微生态制剂在水产养殖动物病害防治中越来越受到重视， 并发挥着调节养殖环境， 控制病害的作用。有效微生物制剂是日本琉球大学比嘉照夫教授等首先研制的由5 科10 属80 余种有益微生物组成的高效能的微生物复合剂。在黄颡鱼卵孵化水中， 当有效微生物制剂浓度增至8μl/ L 时， 水霉病的发生率为5. 82% ; 当有效微生物制剂浓度增至 16μl / L 时再加入50μl/ L 重氢硫酸盐后， 可极显著地抑制水霉病的发生， 水霉病的发生率几乎为0。有效微生物制剂及其增效剂能有效控制水霉病的发生原因主要有: 一是能保持水体益生菌种群数量， 稳定水体pH 值， 补充微量元素; 二是有效微生物制剂抑制了水体水霉的生长繁殖， 使鱼种在池塘中体质尽快恢复， 伤口尽快愈合。应用臭氧配合复合光合细菌处理高密度虹鳟养殖水体， 结果表明， 时隔4d 用臭氧处理1 次水体， 次日投放5% 复合光合细菌可有效治疗水霉病， 而时隔1 周用臭氧处理1 次水体， 次日投放1% 复合光合细菌可有效预防水霉病的发生[ 71]。因此， 在水产养殖中， 合理使用复合微生态制剂拌饵投喂和定期净化水质对水产养殖业的经济效益和生态效益将会产生深远影响。

4. 3 􀀁中草药防治研究

中草药具有抗菌、抗病毒、增强免疫功能， 改善和提高机体抗病能力等作用， 以及副作用少、毒性低、不易产生抗药性等特点， 加之中草药本身含有一定营养物质， 如粗蛋白、粗脂肪、维生素等， 可以提高饲料转化率等特点， 近年来被广泛用于防治各类水生经济动物病害和作为饲料添加剂应用于水产养殖中。研究表明， 五倍子或菖蒲能有效地防治鱼类水霉病的发生， 菖蒲结合化学消毒剂强氯精能有效治疗尼罗罗非鱼水霉病。李川等用中草药对患水霉病大鲵进行治疗， 结果显示大黄和五倍子两种药液均对水霉菌有较好的抑制作用，当大黄质量浓度为0. 4g/ L ( 即用量为大黄干品400g/ m3水体) 时， 对水霉菌有最佳的治疗效果。

中草药可通过阻断或破坏真菌结构及大分子的生物合成、干扰真菌的能量代谢， 或通过调节生物体免疫功能和对其他抗真菌药物的增效作用来杀灭或抑制真菌， 随着提取、分离和结构鉴定技术的迅速发展， 许多抗真菌有效成分得到一定的发掘。中草药的化学成份极为复杂， 其中能防治疾病的有效成份主要包括多糖、生物碱、甙类、挥发油、萜类、鞣质、酮类、蛋白质等。然而在中草药研究方面还需要建立中草药抗真菌作用的筛选标准，分离确认安全高效成分， 积极开展中草药抗真菌分子机理研究， 以及中草药抗真菌药物减毒增效作用研究， 进一步发掘中草药在水产养殖病害防治和免疫增强方面的应用。在鱼类各种疾病预防和治疗中，中草药都有一定的效果， 值得研究和开发，而目前， 鱼用中成药的研究刚刚起步， 今后应加强研发力度， 使中草药在鱼病防治中发挥更大作用。

5 结语

水霉病是养殖水产动物的常见病， 其病原是水霉科的一些种类，其生活史复杂， 对其是真菌还是类真菌生物还存在争议， 鉴定种类应结合传统形态特征和分子生物学技术， 才能作到准确快速。过去一直使用的防治水霉病的有效药物孔雀石绿和甲醛，由于其高残留和强毒性作用， 已被我国和其他国家政府禁用， 目前， 急需要开发出能替代上述禁用渔药的替代品。目前， 正筛选安全有效的化学药物和中草药， 以及采用生物防治方法控制水霉病，都取得了一些进展。尤其是通过微生态制剂调节水环境，以及使用中草药制剂， 对水霉病有明显控制作用， 两者无残留、无污染， 值得进一步深入研究， 开发出安全、有效的综合防治水霉病的制剂。

  (《水产科学》陈本亮 张其中)