鱼类肝细胞分离、原代培养与应用

肝脏是动物机体在在物质和能量代谢过程中负有重要作用的器官，其主要功能有：营养代谢、能量存储、蛋白质合成与分泌和分解毒物等[1]。原代肝细胞培养技术已经被广泛用于研究肝细胞功能、结构等方方面面，如碳水化合物和氨基酸的代谢[2]。鱼类肝细胞的首次体外培养要晚于哺乳动物，Brinbaumb等[3]于1976年用胶原酶灌注法分离了金鱼肝细胞，这是鱼类肝细胞首次在体外培养，此后，以鱼类肝细胞原代培养为对象的研究相继展开。其研究过程经历了短期培养[4]、长期培养到建立细胞系并应用于相关领域，目前有关该方面的报道已有250多篇[5]。

1 鱼类肝细胞的分离

1907年，Harrison[6]为了研究神经突起的起源问题而进行了一项系统的体外培养活体组织试验，标志着体外培养技术的创立。鱼类组织体外培养技术晚于陆生生物。目前，鱼类肝细胞的分离基本上沿用哺乳动物的分离方法，主要方法有组织块法、机械分散法、酶消化法和二步灌流法［6］。目前鱼类肝细胞的分离主要应用二步灌流法和酶消化法[9]。肝细胞在体内具有强大的增殖潜能，在肝脏受损时能够快速增生，但是肝细胞的体外增殖能力较差，原代培养难以成功，在一定程度上限制了肝细胞培养的广泛开展，各实验室对肝细胞分离方法进行了改进，以提高细胞在体外存活时间以及增殖能力。

组织块法和机械分散法对细胞的损伤较大且多为细胞表面蛋白质的机械性损伤，为不可修复性损伤，导致细胞存活率较低。酶消化法对肝细胞的损伤小，能够较完整的保存膜蛋白[10]，是目前采用极为广泛的方法。此法所用的消化酶主要是胰酶或胶原酶，常用的质量浓度是2.5g/L。胡聪[11]将酶法和机械法分离得到的肝细胞进行比较发现,酶消化法得到的肝细胞功能更强,且形态和功能维持在正常水平的时间较长。

1976年Seglen[12]在前人的方法基础上形成了二步灌流法,这是目前国际上流行的肝细胞分离方法,它具有分离效好、细胞产率高、即时存活率高、细胞维持肝特异性功能时间长等特点。具体方法为开腹后注射静脉注射肝素，作门静脉和下腔静脉插管，灌注肝脏获得单个分离的肝脏细胞。为了肝细胞的最终分离必须用不含Ca2+的螯合剂（如EDTA）预灌注螯合掉肝组织中的Ca2+，打破固定细胞的细胞桥粒样结构，而后灌注消化酶，充分消化肝组织后，去除肝被膜以及血管，钝性撕裂肝组织，分离至培养液中，通过离心分离得到纯化肝细胞。相对酶消化法而言，二步灌流法收集的细胞多，活力强，易于培养。但是二步灌流法操作复杂、成本较高（需要大量胶原酶）、需要灌注机，并且对于被解剖结构细小的鱼类，不适宜用此方法。然而酶消化法操作简单，不需要用特殊的仪器，可以应用于鱼类大多数组织的分离，目前很多研究者已用胰蛋白酶消化法代替二步灌流法分离肝细胞。

肝细胞分离时杂细胞的去除是至关重要的。无论采用何种方法分离肝细胞,都存在肝细胞纯化的问题。与酶消化法相比,用组织块培养得到的细胞中成纤维细胞所占的比率较大，肝组织由肝细胞和其他杂细胞组成(表1)，血细胞和其他组织碎片对肝细胞的培养有一定影响。主要的常用分离方法有差速贴壁法、梯度离心法、Percoll分离技术，因Percoll分离技术代价较大，通常采用低速梯度离心来纯化肝细胞[13]。

2 鱼类肝细胞的培养以及影响因素

2．1 鱼类肝细胞的培养

肝细胞的培养有多种方法[14]（如微囊培养法、微流体通道培养法、双层胶夹层培养法等），但是由于鱼类肝细胞存活率较低不适用悬浮培养，大多数实验通常采用单层贴壁培养法。。对鲤鱼(Cyprinus carpio)[14]的研究表明，细胞接种后12～24h贴壁，细胞形状从圆形变成扁平。细胞单层贴壁培养受到各种因素的影响，如培养基、细胞培养环境、血清和各种生长因子。

2．2 影响鱼类肝细胞培养的因素

2.2.1肝细胞的来源

供体的选择对于鱼类肝细胞分离与培养十分重要，肝细胞的生长活力程度与生长旺盛程度有关，而大部分鱼的生长旺盛程度又与季节有关，在鱼类的生长旺季分离肝细胞成功率较高。取材动物必须健康、生理状态良好。有研究［15］认为供体鱼的体重、年龄和性别也会影响肝细胞的分离，在大多数试验中常选用100～200g，年龄较小的鱼进行试验。

2.2.2培养环境

肝细胞的培养环境主要包括：温度、pH值、渗透压和贴壁环境。

温度 鱼类肝细胞体外培养的温度应该与其体内环境相似，因此鱼类肝细胞体外培养的温度与供体鱼的种类有关，温度对细胞活力的影响可能和细胞细胞膜上不饱和脂肪酸和细胞内蛋白质的合成有关。

pH值 鱼类肝细胞培养的最适pH一般为 6.8～7.4。pH值过高或过低，会影细胞内生理生化反应，这一点和哺乳动物一样。肝细胞体外培养时，缓冲液和CO2的相互作用为细胞创造了稳定的pH环境，NaHCO3溶液和NaH2PO4/Na2HPO4溶液是最常用的缓冲液，浓度一般为4～8mmol/L。

渗透压 为了模拟与体内相同的环境，鱼类肝细胞体外培养时需提供与体内相似的渗透压[14]，确保诸如K+、Na+和Cl-等离子的运输与交换。

贴壁环境 Segner[9]认为不同的鱼类肝细胞贴壁数量不同可能与肝细胞表面特殊的化学物质有关。单层培养过程中，鱼类肝细胞在普通的培养皿内很难附着，为提高细胞接种率，通常在细胞培养板底部涂一层基质或者用Falcon Primaria培养板。

2.2.3培养基和血清浓度

不同鱼类的肝细胞对营养物质的需求也各有差异，因此所需的培养基不同，但大多数鱼类肝细胞培养时用M199或L-15培养基。不同的培养基含氨基酸、无机盐、维生素等物质比例不同，不同鱼类肝细胞培养的最适培养基也不同。研究表明，M199培养基更有利于鲫鱼肝细胞贴壁和增殖[15]。然而总体看来，M199与L-15培养基二者哪一个更适合鱼类肝细胞体外培养，观点尚未达成一致。

血清是鱼类肝细胞体外培养的添加物之一。血清中含有各种营养物质（增殖因子、附着因子和蛋白质消化阻止因子等），还可以提供多种载体蛋白促进细胞贴壁和生长。胎牛血清或小牛血清较常用于鱼类干细胞体外培养基中。不同的鱼类肝细胞 对血清的最佳需求也不同，研究表明鲫鱼肝细胞在含不同浓度血清的M199 培养基中，细胞的贴壁和增殖都受到不同程度的影响，结果显示含5%和10% FCS的培养基中细胞贴壁数量最多[15]。Kocal等发现在无血清培养基中虹鳟肝细胞的贴壁率低于10%，且不能铺展开[16]。

3 鱼类肝细胞体外培养技术的应用

3．1营养学研究

大量研究已经表明体外培养肝细胞可以作为在体培养肝组织模型用于研究，并有着节约动物数量、缩短试验时间、排除体内其他因素干扰等优点。鱼类肝细胞已被作为替代模型研究肝脏代谢功能，如维生素B6对草鱼脂代谢的影响[17]，瘦素对黄颡鱼肝细胞脂代谢的影响[18]，铜对草鱼和黄颡鱼肝细胞脂代谢的影响[18]，通过原代培养的鱼类肝细胞研究肾上腺素对Ca2+浓度的影响[19]等。

3．2环境毒理学研究

肝脏具有分解毒物的功能[1]，近年来，在毒性研究和异生物质代谢研究方面，鱼类肝细胞已经作为一种模型来研究毒理学。利用体外模型克服了活鱼进行毒理学研究周期长、成本高、有一定设备要求等弊端，让整个实验进程变得易操作，减少了动物使用量，节省实验费用以及时间，并可同时检测多种物质多个浓度的细胞毒性,为体外高通量筛选模型的建立奠定了基础[20]。Goksoyr[21]用大西洋鲑肝细胞研究PCB－105、BaP、BNF和重金属对蛋白质表达的影响，结果显示多环芳香烃化合物和重金属均诱导45 Ku蛋白的表达。多环芳香烃化合物也会诱导 CYP1A 酶的活性。

3．3疾病学研究

水产养殖业中，降低水产品死亡率是保证产量的关键。从根本上解决和预防水产品病毒病的关键是要查清病毒的感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗对水产品进行免疫预防,而建立新的细胞系是进行病毒研究的理想体外研究体系和制备病毒疫苗的有效方法。任秉新[22]将大菱鲆（Scophthalmus maximus）肝细胞进行体外培养并用于疫苗研制，成功研制出具有高度安全性并且可用于大菱鲆预防免疫的TRBIV疫苗。

4 总结

到目前为止，肝细胞分离的实验动物主要为人、猪、狗、大鼠、小鼠等，其中胚胎、新生动物和成年动物均有报道。世界上约有25000~30000种鱼类，然而只有40多种鱼的肝细胞被分离和应用，其相关研究较哺乳动物而言起步较晚成果较少，由于研究的需要，创造更高效便捷的肝细胞分离方法以及培养方法，建立不同的鱼类肝细胞系是细胞培养继续探讨的一个方向。

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