用于连续生产理想壳寡糖的壳聚糖酶与碳水化合物结合模块融合的工程研究

壳寡糖(CHOS)是一种具有抗菌活性的生物相容性阳离子多糖，因为它能粘附在细菌细胞壁上，抑制细菌的新陈代谢。CHOS是壳聚糖的水解产物，具有粘度低、溶解度高、吸湿性好、吸附能力强、生物相容性好等特点，在化妆品、制药、农业和食品工业中有广泛的应用。目前，CHOS的生产方法有化学、物理和酶法三种。其中，酶催化降解壳聚糖或甲壳素具有反应条件温和、环境可持续、选择性或特异性高等优点，具有广阔的应用前景。

已经开发的多种酶固定化技术（包埋、交联和载体结合），实现了产品、底物和酶的高效生产和分离。然而，在大多数情况下，固定化之前需要对酶进行纯化，还需要将产物从底物和残留酶中进行繁琐的下游分离。此外，酶的可重用性和稳定性仍然是酶固定化在实际生产中应用的主要瓶颈。

最近，将酶与碳水化合物结合模块(CBM)融合的策略已被证明在一步纯化和固定化中是可行的。CBM是碳水化合物酶中广泛存在的一个小结构域，可以特异性地识别和结合碳水化合物，特别是不溶性多糖。用于固定化的载体一般是天然或食品安全的多糖，如纤维素、甲壳素和微晶纤维素。这一策略已经被发现可以改善融合酶的性质，包括它们的稳定性、活性、选择性和特异性。

在以前的研究中，CBM融合酶的表达主要是在大肠杆菌中进行的，因为大肠杆菌总是产生胞内酶，因此需要破坏细胞。毕赤酵母作为一种高效的表达系统，只分泌少量的自身蛋白，因此在工业应用中可以大大降低酶的纯化成本。然而，毕赤酵母中的糖基化在某些情况下会降低重组CBM的底物亲和力。此外，大多数CBM的固定化载体是纤维素，其结构在与CBM结合后也会受到影响。因此，寻找一种与酵母表达系统相容性好的CBM是实现壳聚糖酶一步纯化和固定化的主要挑战。

BhCBM56是Bacillus haloduransβ-(1，3)-葡聚糖酶的CBM，在固定化中是一种很有前途的酶融合选择。农杆菌水不溶性线性β-(1，3)-葡聚糖是一种安全、廉价的BhCBM56固定化载体。此外，我们还发现烟曲霉CJ22-326产生的壳聚糖酶Csn75能有效地制备聚合度较高的CHOS。因此，可以利用BhCBM56作为CBM，在C端融合Csn75，在毕赤酵母中表达重组酶，最终实现Csn75的一步纯化或固定化。

在本研究中，我们以BhCBM56为CBM，Csn75为模型酶，将壳聚糖酶融合到碳水化合物结合模块中，以连续生产所需的CHOS。在毕赤酵母高效胞外表达和高密度发酵的基础上，建立了壳聚糖酶固定化热凝胶多糖填充床反应器(CICPR)，并进行了连续生产CHOS的性能试验。并对不同的反应条件(如壳聚糖酶量、流速、底物浓度)进行了优化。在此过程中，还对CICPR的稳定性和可重用性进行了评估。

Csn75、Csn75-CBM和Csn75-2CBM的表达与特性

重组酶Csn75-CBM和Csn75-2CBM在P. pastoris GS115中成功表达。SDS-PAGE分析证实了Csn75、Csn75-CBM和Csn75-2CBM酶在胞外的表达(Fig. 1A)。预测了三种酶的分子量分别为25.5 kDa、35.2 kDa和47.0 kDa。此外，三种发酵上清液中蛋白质含量无显著差异，说明三种酶的胞外表达量是相近的 (Fig. 1B)。但是重组酶Csn75-CBM和Csn75-2CBM的活性分别下降到天然Csn75的75.7%和25.4%。因此，为了保持较高的酶活力并实现酶的固定化，作者选择了Csn75-CBM进行进一步的研究。

Csn75和Csn75-CBM的活性中心分析

根据氨基酸序列预测了天然Csn75(Fig. 2A)和重组酶Csn75-CBM(Fig. 2B)的三维结构。壳聚糖水解的可能催化位点(D143和E152)用粉红色表示，CBM中可能的Curdlan结合位点(Y266、D268和H270)用红色突出显示(Fig. 2B)。重组酶Csn75-CBM既具有壳聚糖水解的催化活性(由Csn75提供)，又具有与热凝胶多糖的结合能力(由CBM提供)。这两种功能为重组酶Csn75-CBM的进一步纯化和固定化提供了可能。

Csn75和Csn75-CBM的高密度发酵及酶谱分析

重组质粒GS115-pPIC9K-Csn75 (Fig. 3A)和GS115-pPIC9K-Csn75-CBM (Fig. 3B)对高密度发酵液上清液的SDS-PAGE分析表明，Csn75和Csn75-CBM酶是其上清液中的主要蛋白质。酶谱分析用来评价重组酶Csn75-CBM对壳聚糖的亲和力。粗制和纯化的Csn75和Csn75-CBM在变性SDS-PAGE凝胶(Fig. 3C)上的条带与酶谱凝胶(Fig. 3D)上的条带一致，表明将CBM引入Csn75并不影响重组酶对底物的亲和力。只有粗制和纯化的Csn75和Csn75-CBM在酶谱凝胶上显示出清晰的斑点(Fig. 3D)，表明Csn75和Csn75-CBM是其发酵上清液中仅有的具有壳聚糖酶活性的蛋白质。

Csn75和Csn75-CBM的酶学性质比较

为了评价融合CBM对Csn75酶性质的影响，比较了它们的催化活性、pH和热稳定性。在醋酸缓冲液(0.2 M，pH 6.0)中，50 ℃时，Csn75-CBM的活性为10.26±0.77 U/mL，略低于Csn75的活性(13.56±0.86 U/mL)。Csn75-CBM的最适pH为5.0，而Csn75的最适pH为5.5 (Fig. 4A)。Csn75和Csn75-CBM在pH 4.5-8.0范围内均表现出良好的催化稳定性，相对活性均在90%以上(Fig. 4B)。Csn75-CBM的最适温度为50-60 ℃，略低于Csn75(55-65 ℃) (Fig. 4C)，表明Csn75-CBM的温度比Csn75要温和。在50 ℃孵育2 h后，Csn75-CBM的相对活性仍为82.60%，而Csn75的相对活性仅为70.11% (Fig. 4D)。

热凝胶多糖对Csn75-CBM的吸附性能

FE-SEM分析表明，溶胀的凝胶颗粒(约300 μm)比未溶胀的凝胶颗粒(近10 μm)大得多(Fig. 5A, B)。溶胀的凝胶颗粒具有较好的流动性和疏松性，是一种良好的载体。为了进一步证实热凝胶多糖是否能吸附重组酶Csn75-CBM，用CLSM对FITC染色的热凝胶多糖进行了分析。在重组酶Csn75-CBM(Fig. 5C)处理前，凝胶颗粒表面几乎没有绿色荧光，但经重组酶处理(Fig. 5D)后，凝胶颗粒表面观察到强烈的绿色荧光。这表明重组酶Csn75-CBM被热凝胶多糖成功吸附。

为了更好地实现固定化，通过固态耗竭来评估最大吸附容量。重组酶Csn75-CBM固定化后，热凝胶多糖体积增加了5倍(Fig. 6A)，填充床呈乳白色(Fig. 6B)。固态耗竭实验表明，Csn75-CBM对热凝胶多糖的吸附曲线符合Langmuir吸附等温式，相关系数R2=0.9777(Fig. 6C)。Pichia pastoris胞外表达的Csn75-CBM (Fig. 6D)具有“切割”和“锚定”双重功能，分别由“Csn75”和“CBM”贡献。这使得Csn75-CBM可以一步被热凝胶多糖提纯和固定化(Fig. 6E)。将Csn75-CBM填充到热凝胶多糖填充床反应器中，制备了CICPR。壳聚糖在流经CICPR时将被重组酶Csn75-CBM水解(Fig. 6F)。

固定化Csn75-CBM在填充床反应器中的性能

为了在满足生产要求的同时节约酶的用量，对酶的负载量进行了研究。结果表明，当酶的负载量小于40 U (Fig. 7A)时，CICPR不能完全水解底物；而当负载量大于60 U时，CHOS的DP较接近。因此，酶的可选负载量应为60-100 U，不超过CICPR的最大负载量(200 U)。

作者进一步研究了壳聚糖浓度对水解液中CHOS聚合度的影响。底物浓度降低会导致水解物中CHOS的聚合度降低(Fig. 7B)。在连续生产过程中，流量对生产效率有很大影响。随着流速的降低，水解液中CHOS的聚合度降低(Fig. 7C)。这些结果证明，只要调整工艺参数，CICPR对于连续生产理想的CHOS是可行的。为了得到具有理想DPs的CHOS，对三种给定条件下的水解物进行了定性和定量测定(Fig. 8A, B, and C)。结果表明，在条件Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ条件下，水解液中的主要产物是聚合度为2-5(水解率为97.75%)、3-6(75.45%)和3-7(73.2%)的CHOS (Fig. 8D)。冷冻干燥后，产品在三种条件下的颜色分别为乳白色、淡黄色和棕黄色(Fig. 8E)。CICPR能以理想的DP实现CHOS的高效生产。此外，该酶的固定化也实现了壳聚糖在CICPR中水解的多相催化。

CICPR的稳定性和可重用性

CICPR的稳定性和可重用性是评价其在连续生产，特别是大规模工业生产中可行性的重要指标。在4 ℃下保存5、10、15和20 d后，CICPR的催化活性保留率分别为97.8%、95.6%、92.0%和88.3%。20天后，CICPR的催化活性仍保持在88%以上(Fig. 9A)。这表明CICPR具有良好的稳定性，有利于其在实际生产中二次应用的灵活性。为了进一步验证CICPR的可重用性，检测了还原糖的残留量(Fig. 9B)。结果表明，CICPR在5次循环后仍保持86%以上的水解活性，表明CICPR在实际生产过程中表现出良好的稳定性和可重用性。

为了实现连续生产，进行了补料分批发酵，包括酶的分批补料、平衡和水解三个步骤。用HPLC(Fig. 9C)和QTOF-MS(Fig. 9C)检测水解液中CHOS的浓度。QTOF-MS分析表明，Csn75-CBM的水解产物是一种高聚合度壳寡糖，包括(GlcN)2(m/z341.16)、(GlcN)3(m/z502.22)、(GlcN)4(m/z663.29)、(GlcN)5(m/z824.36)和(GlcN)6(m/z985.43)，和低聚合度壳寡糖，包括(GlcN)2-GlcNAc(m/z 544.24)和(GlcN)3-GlcNAc(m/z705.29) 的混合物。观察到CICPR在补料分批发酵后可以更新，因此可以连续生产CHOS。

在这篇文章中，作者利用Pichia pastoris细胞外表达了一种CBM融合壳聚糖酶(Csn75-CBM)。Csn75-CBM表现出比Csn75更高的热稳定性，并具有与热凝胶多糖特异结合的能力，使一步纯化和固定化成为可能。基于这一功能，建立了固定化Csn75-CBM填充床反应器(CICPR)，用于连续生产具有理想DP的CHOS。通过调整酶与壳聚糖的比例或壳聚糖的流量，连续生产出聚合度为2~5(水解率为97.75%)、3~6(75.45%)、3~7(73.2%)的壳聚糖。CICPR的良好稳定性和可重用性使其有可能大规模应用于实际生产，并将极大地降低下游生物工艺的成本，也将为酶催化连续生物合成绿色化学品或生物降解环境污染物提供更多的启示。