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关于鱼类的抗应激
近几年来，水产养殖过程中引起应激的因素越来越多。如水质恶化、药物滥用、疾病爆发、饲养管理不当等等，这些都直接影响着养殖动物的正常生长与发育，甚至会引起大范围的严重疾病或者死亡。这篇文章主要阐述了应激的概念、鱼类应激的发生机制和行为表现，以生鱼的养殖为例而列举了养殖过程中的应激源及抗应激药物，并主要从生理、行为方面介绍了目前国内外鱼类应激生物学最新的研究技术和方法，旨在为从事水产行业的人员进行简单的科普与参考。
1．应激及应激源的概念
1936年，加拿大学者Selye首先提出了应激的概念，他认为应激是动物受到体内外环境改变的刺激后，机体自我调节达到新的动态平衡所产生的一系列非特异反应的总和。应激可分为惊恐、抵抗和衰竭三个阶段，它是动物自身演化过程中产生的自我保护的自然反应[1]。由应激所引起的非特异性变化又称为“全身适应综合症”，即现在所说的应激综合症[2]。应激是鱼类对不良环境因素刺激的忍受达到或接近极限时所表现的异常状态，而不是一种独立的疾病。凡是偏离鱼类正常生活范围的不良刺激因素就是应激源( stressor)。
2. 应激的发生机制、行为表现及检测方法
2.1 应激的发生机制
科学家Moberg在1985年提出将应激分为应激源识别、生物防御和应激反应结果三个阶段。鱼类应激反应的发生与人类和其他脊椎动物相似，也适用于这一模型[3]。
当鱼体中枢神经系统感受到内外界刺激后，鱼体将从行为、生理(自主神经系统神经—内分泌—免疫系统)等方面发生生物防御反应。行为反应是鱼类遭受刺激后最直接、快速的反应。自然环境下，适当的行为反应是鱼类躲避或应对应激源刺激的有效途径，对鱼类在短期内恢复正常状态至关重要[4]。高密度的生鱼养殖模式，其行为反应必定会得到限制，从而导致行为异常或障碍，引起生理系统的应激反应。陈平洁等[5]认为拥挤胁迫会引起机体能量消耗增大，并通过消耗体内能源物质来满足，主要表现为血液葡萄糖水平升高，糖异生作用加强，动员甘油三酯参与糖类代谢。换句话说，在应激状态下鱼类用于生长和保障健康的物质和能量减少，导致鱼类生长减缓和免疫力下降，这就是饲料系数增加的重要原因。总的来说，应激反应机理十分复杂，动物作为一个有机整体，通过神经-内分泌途径来动员大部分器官和组织来缓解应激源的刺激。在这个过程中，中枢神经系统起着“命令”作用，而交感一肾上腺髓质系统和垂体一肾上腺皮质系统等则起“执行”作用[6]。应对应激过程中参与的激素主要有糖皮质激素[7]、盐皮质激素，其次还有生长激素、胰高血糖素、肾上腺素、去甲肾上腺素等。
应激导致的出血症是生鱼养殖当中最常见的应激反应结果，如图1所示，其发病的鱼通常表现出体色较黑、肛门轻度红肿、体表（特别是腹部）鳞片边缘变红、肝脏肿大且质地较脆、脾脏淤血肿大，呈紫黑色等症状，与汪开毓等人[8]在鲤鱼应激发现的应激性出血症的病理十分相似，这种出血病通常分离不到病原微生物，是一种非传染性疾病。
图1.生鱼应激性出血症状
a：体表鳞片边缘变红、肛门轻度红肿、体表有粗糙感
bcd：肝脏肿大且质地较脆、脾脏淤血肿大，呈紫黑色、肠道出血
ef：独游、侧翻
2.2 应激的行为表现
鱼类受到应激后会产生适应性行为，生鱼也不例外。如图2所示，生鱼适应性反应三个阶段变化：第一阶段为机体神经内分泌活动的变化，即惊恐反应阶段，主要表现为警觉性增加、活动加强、呼吸加快、顶流逆进、群体活动明显，躁动不安及争向水面活动，进而表现惊恐逃避、集群乱窜。经过一定时期后，鱼类进入第二阶段的应激状态，即适应阶段，此时机体发生了一系列生理、生化、免疫的变化，在此阶段体内生理状态出现紊乱，调节机制发生作用，使鱼体保持在协调状态。第三个阶段即衰竭阶段，是适应阶段中体内调节失控的情况下，出现的活动减少、游动缓慢、群体聚集势头降低、单独游动至水面不吃食、轻微浮头，逐渐发展至严重浮头、体色变深、肚腹朝上、时沉时浮或沉入水底、侧睡不动，接近死亡[9]。
图2.生鱼应激的三个阶段行为表现
• abc：第一阶段(惊恐、乱串、顶流逆进和群体活动明显)
• de：第二阶段（适应、较平静）
• fgh：第三阶段（独游、侧翻、衰竭）
2.3 应激的检测方法
现在国际上流行的检测动物应激的方法主要有两个方面：血液生理生化指标和应激蛋白的表达量。皮质醇激素和血糖检测鱼类应激反应强度是血液生理生化中的良好激素指标，皮质醇激素在鱼类应激检测与评价中研究最多，它具有稳定性高、其强度与应激的持续时间和强度成正相关的特点[10]。
此外，鱼类及其他陆生脊椎动物都具有认知或感知能力[11]。生鱼受到应激后的行为变化是最直接、快速的反应，因此也可通过鱼类行为来对应激进行检测。程炜轩等[12]发现唐鱼在微囊藻毒素的胁迫下，摆尾频率和游泳速度都显著下降；在孔雀石绿的胁迫下，游泳速度显著下降。此外，科学家van Raaij[13]对缺氧及恢复过程中的虹鳟进行了观测，根据鱼的逃跑行为、呼吸频率建立相应的行为参数，结果显示：实验中存活的虹鳟在应激后没有恐慌行为，表现得较为安静，而最后死亡的虹鳟在应激后有较为剧烈的躲避行为，且后者体内儿茶酚胺及皮质醇含量均比前者高。overli等[14]、Kittilsen等[15]利用摄食行为和活动量对新奇环境和急性应激下的虹鳟和大西洋鲑进行了研究。结果显示，应激状态下雌雄虹鳟行为学反应差异明显；不同家系大西洋鲑在急性应激状态下其活动量和皮质醇浓度均有显著升高，且两者高度相关。姚浪群等[16]认为在应激条件下，动物采食量会普遍下降，这是应激给动物带来的最致命的生产表现。事实证明，在生鱼的养殖过程中，遇到高温、换水、转料等应激因子，摄食速度和摄食量也会相应降低。以上研究结果表明，应激反应中鱼类行为的变化与其认知、生理指标波动、应激损伤状况密切相关，能够客观、形象地反映其应激状态与程度。运用行为的方法对应激强度进行研究具有方便、快捷、简单、实用等优势。3. 养殖当中存在的应激源及应对对策
水生生物生活在水环境中，相对于陆地环境显得多变和不可预测，而高密度养殖的生鱼更使其生活的水环境比其他一般四大家鱼更加复杂。如表1所示，在生鱼养殖的过程中，影响生鱼生长、生存的应激因子大概可以分为四类：
第一类为人为管理因素：如图3所示：拉网、运输、投喂策略、饲料变质、人为惊扰、及常见的加水、捕捞、运输等生产操作，这些因素对生鱼应激的强度和持续时间主要取决于操作者的养殖素质以及对操作执行的规范程度。如在拉网操作中，是否严格按照操作方式停料、消毒、泼洒抗应激药物等，这些细节都会影响生鱼的损伤程度和死亡量。如图4所示，不同的加水方式对生鱼的应激程度不一样，此外应激程度还与加水量、加水的水质情况有密切关系。
第二类为环境因素：如水体的氧气、水温、氨氮、亚硝酸盐、酸碱度、药物残留、底质恶化、天气突变、酸雨等。此外，由工农业及城市生活废水导致的重金属、石油、农药等污染也是重要的环境应激源，这就要求在养殖生鱼的过程中必须保持这些环境因子稳定。维持水质的方法有很多，不同环境因子所应对的措施不同。
第三类为微生物因素：如生鱼养殖过程中会遇到病毒、细菌（如：诺卡氏菌、舒氏气单孢菌）、寄生虫（如车轮虫）等微生物的入侵。诺卡氏菌在生鱼养殖的7~9月容易爆发，发病率较高，症状主要表现为体表、鳍条充血，肝、脾、肾等内脏器官出现直径1-5mm的乳白色结节。
第四类为生物因素：是指养殖动物受到自然界的某些敌害生物的影响，例如水生昆虫、凶猛鱼类、水生昆虫、水螅、水鸟、甚至是生鱼之间的残食等，这些都会直接或间接在产生应激。以生鱼为例，生鱼鱼苗阶段的虾钳虫、蝌蚪、青蛙、以及苗期的残食等是最常见的应激源。如生鱼之间残食大多数由于投喂不当造成生鱼规格产生差异，应对的策略首先少量多次投喂（苗期每天喂6餐）；再次，当生鱼长到一定规格后，规格不齐且存在残食现象则需要及时分晒、去掉“炮头”。
表1生鱼养殖过程中的应激源图示
图3. 生鱼日常管理中常见人为因素应激源
a：加水b：药浴 c：改底 d：杀虫 e：投喂 f：过塘 g：拉网 h：运输
图4. 不同的加水方式对生鱼的应激
a：应激强度大 b：应激强度小
4.养殖中常用的抗应激产品及作用机理
确定鱼类受到了应激后，就需要采取措施减少应激对鱼类的伤害，现在市场上产品主要从两个方面降低应激对鱼体的伤害：一是降低和缓解应激源，另一方面是增强鱼体抗应激能力。活宝源公司推出的应激宝是结合了两个方面进行配方设计，最终达到缓解应激的目的。
在养殖过程中，养殖户经常会用到抗应激药物来减少或缓解应激源给鱼造成的伤害，因而催生了很多具有缓解、防治应激源的抗应激药物。目前养殖过程中常用的抗应激药物包括葡萄糖、多糖类(活性多糖、植物多糖等)、维生素类、氨基酸类(赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、牛磺酸、谷氨酰氨等)、电解质矿物元素类(小苏打、氯化钠等)、有机酸类(柠檬酸、果酸、月桂酸等)。
市场上抗应激药物种类繁多，其发挥抗应激的作用机理也各有不同，按照其使用的时期可以分为两个个方面：一是应激源出现前：生鱼养殖户在暴雨天气来临之前、转塘、拉网之前等可预见的应激源使都会采取抗应激措施，分为内服、泼洒两种。如苗期暴雨来临前池塘泼洒应激宝可起到抗应激作用，在转塘、拉网前内泼洒应激宝可起到抗应激作用，减少应激对生鱼机体的损伤，起到了调节中枢神经系统，起安定镇静、降低生鱼应激敏感性作用。二是应激源出现后：常常采取解毒、缓解等措施。如在使用杀虫、消毒等药物后，水中的药物残留对生鱼具有应激作用，用氨基酸解毒剂、维生素C、葡萄糖等进行水体解毒，如解毒剂中的EDTA、有机酸等对重金属具有络合作用，起到解毒抗应激作用。如环境因子亚硝酸盐含量忽然升高，则应该泼洒食盐，一方面调节盐度，从而使水生动物体内的渗透压和外界保持在一个安全的生态幅度上，从而解毒，另一方面释放的氯离子可与亚硝酸基团竞争，缓解亚硝酸盐的毒性。
抗应激的产品虽然很多，但机理却各有不同，下面主要介绍葡萄糖、多糖（聚糖）、Vc及衍生物、有机酸四类物质的抗应激原理：①葡萄糖的抗应激机制：鱼类的糖代谢以糖酵解和糖异生两个过程为主[17]。鱼类遇到应激反应时，肝脏发生糖异生反应，使血液中的葡萄糖会骤升，准备充足的能量以应付应激源的影响，但这个过程比较慢，如果直接泼洒葡萄糖对于能量的及时补充具有重要作用。葡萄糖经过糖酵解过程可以提供大量ATP，提高机体抵抗力，降低肝脏糖异生的负面影响，提高抗应激能力；另一方面，葡萄糖可增加池塘C源，有利于藻类和有益菌繁殖改善水质，这可能也是葡萄糖间接抗应激的一个原因。②多糖的抗应激机理在于提高机体免疫力，以β(1,3)-葡聚糖为例，孙翠慈等[18]研究表明，动物处于应激状态时体内分泌糖皮质激素和甾类皮质激素等水平升高会引起机体血淋巴细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞及溶菌酶的活性急剧下降，此时机体的免疫系统受到抑制。一般而言，在鱼类非特异免疫系统中，巨噬细胞和嗜中性粒细胞起着关键作用，这类细胞的细胞膜上的β(1,3)-葡聚糖受体β(1,3)-葡聚糖结合，以促进巨噬细胞的向病灶迁移，提高活性氧自由基产量和血细胞溶解作用，使抗应激反应能力提高。③Vc的抗应激作用在于它在脯氨酸羟化为羟脯氨酸中扮演着重要角色，鱼类一般不能合成Vc，生鱼的膨化料中Vc在高温高压的条件下Vc会被破坏，因为内服或泼洒Vc对提高机体免疫力和抗病力具有重要意义。在鱼类Vc的研究中，秦启伟[19]研究了Vc对青石斑鱼的非特异性免疫调节作用，Vc能提高血液中白细胞的数量和吞噬活性，并能促进机体的生长，对青石斑鱼的非特异性免疫系统调节作用效果明显。④有机酸的抗应激作用主要在于其酯化反应以及络合作用：有机酸种类有很多，最常见的有机酸是羧酸 (-COOH)。另外磺酸 (-SO3H)、亚磺酸(RSOOH)、硫羧酸(RCOSH)等也属于有机酸。常用的抗应激有机酸有延胡索酸、柠檬酸等，鱼类的在鱼类糖代谢过程中，主要涉及糖酵解、糖异生、三羧酸循环、磷酸戊糖途径、糖原合成和降解等过程，柠檬酸和延胡索酸可以进入三羧酸循环，提供能量物质ATP，由于动物糖代谢以三羧酸循环为主，因而，柠檬酸和延胡索酸在畜禽抗应激上具有广泛应用[20]。另外有机酸能和重金属发生络合反应，从而阻碍重金属进入细胞内和酶产生反应，以达到解毒目的。
5. 抗应激技术的发展方向
从某种程度上来说，生鱼养殖的过程中应激源无处不在，要想从根本上解决应激对生鱼的危害，必须对应激的防制采取综合措施，建立科学的生鱼抗应激防控体系。其方向主要有以下几个方面：抗应激生鱼苗的培育与改良、科学的生鱼管理与规范化操作、改善生鱼养殖环境、正确使用抗应激产品。
5.1 抗应激鱼苗的培育与改良
选用抗应激品种的选育和改良是一个重要方向，在畜禽的（鸡和猪）的养殖当中已经取得了很好的效果。在鱼类的选育上，已经在鲤鱼、虹鳟、金头鲷、大西洋鲑等鱼类进行了应激耐受性选择实验。Overli等[21]通过约10年的选择性改良，培育出了高、低应激耐受性两个不同家系的虹鳟，且这两个品系在食物利用率方面具有显著性差异。Ruiz-Gomez等[22]的研究结果显示，虹鳟应对应激反应的行为策略具有可塑性。这说明，通过适当的驯化，可提高鱼体对应激的耐受性，尤其鱼类早期阶段的应激经历(或建立的条件反射)，可增强其后期对应激的适应能力[23]，。
5.2 科学的管理与操作规范化
在养殖过程中，从鱼苗到成鱼的每个环节都有给养殖生物带来应激的可能，如果能建立一套科学的管理和规范化的养殖体系，把这种人为因素带来的应激源减低到最低，将极大降低养殖风险。这主要包括：养殖地的选址、生产规划的确定、养殖模式的高效以及在养殖过程中拉网、泼药、投喂、转塘、加水等操作进行统一规范，使之科学合理。
5.3 养殖环境的改善
养殖环境是鱼类赖以生存的重要物质条件，与应激的发生密切相关。生鱼的养殖也不例外，良好的水质是保证鱼类健康生长的基本条件，而良好的底质又是良好水质的必要条件。有研究表明养殖设施的结构、背景颜色、水流、水温、光照、养殖密度、规格及品种搭配等均可对鱼类的应激产生影响[24]。Gwak的研究证实，遮蔽物的存在显著提高了美洲黑石斑鱼幼鱼的特定生长率[25]。如图5所示，在顺德生鱼养殖当中，很多养殖户喜欢在养殖水面上种植一定面积的通心菜或水草，这在一定程度上可以提供生鱼躲避地，让体质弱的生鱼缓解高密度下养殖带来的拥挤胁迫。
图5. 丰富养殖环境，提供生鱼躲避地
5.4 正确使用抗应激产品
利用药物缓解鱼类应激反应是水产养殖生产中广泛应用的措施。活宝源生物推出的应激宝就是根据养殖动物应激的原理设计而成。它的主要作用机理有四个方面：第一、提供能量：养殖动物受到应激后，需要大量的能量物质进行躲避与逃离危险地方，这是动物的天性，一般而言，养殖动物受到应激后，需要肝脏中的肝糖原大量转化为能量物质，必然对肝脏造成巨大损失，应激宝含免疫多糖等能量因子，免疫多糖经过糖酵解过程可以提供大量ATP，提高机体抵抗力，降低肝脏糖异生的负面影响，提高抗应激能力；第二、维持体液渗透压：养殖动物应激后会大量流失身体中的微量元素，应激宝中还有点微量元素可以快速补充，缓解由于微量元素的流失造成血液中渗透压的变化；第三、降低光照对动物体的影响：应激宝可以有效缓解光照对鱼的刺激。（光照对养殖动物有极大的刺激,如加州鲈要光线暗时才吃料，养殖户刮鱼一般选择早晨弱光时）；第四、解药物毒素：对氯制剂、强氧化性药物中毒有明显的作用。（如过量使用二氧化氯，漂白粉，强氯精等后引起鱼应激）。
结语
综合来讲，养殖过程就是一个维持稳定的节奏，减少应激源，增强养殖生物的体质，使养殖生物健康生长的过程。我们在养殖过程当中，减少应激对鱼养殖动物的伤害，才有可能获得成功。在未来，当我们的集约化和工厂化程度越来越高时，我们的养殖总是围绕着如何维持稳定，减少应激的思路出发，到那时健康的抗应激的技术将会得到更加广泛的运用和发展。
参考文献：(略)
(作者：顺德活宝源生物科技有限公司 黄志东)
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