海胆不同亚群遗传性分析

光棘球海胆（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ　ｎｕｄｕｓ）属棘皮动物门、游在亚门、海胆纲、正形目、球海胆科［１］。在国内某些文献中有时也称大连紫海胆，日文文献中称为北方紫海胆。光棘球海胆是西北太平洋沿岸海域较常见的经济类海胆之一，也是中国北方沿海重要的增养殖经济种类，主要分布于辽东半岛、山东半岛的黄海一侧海域及渤海海峡的部分岛礁周围。光棘球海胆的壳径可达１００ｍｍ以上，成熟季节生殖腺呈橙黄色，色泽鲜艳，品质上佳，是中国北方重要的出口海珍品之一。自光棘球海胆人工育苗首次获得成功后［２］，其人工养殖和育苗生产开始受到人们的关注［３－５］。目前，该种已成功在山东、辽宁沿岸开展规模化增养殖并取得了良好的经济效益。开展光棘球海胆不同地理亚群的遗传多样性研究，对保护并合理开发利用光棘球海胆的种质资源，在优良抗逆品种的选育过程中开展种质鉴定和亲本选择，促进光棘球海胆养殖业的健康和持续发展都具有重要的意义。采用分子标记对海胆遗传多样性分析的研究，国内外已有相关的报道［６－１０］。ＡＦＬＰ技术具有多态位点检测率高、重复性好、所需ＤＮＡ样品较少、不需要提前预知任何遗传信息、可以一次性得到大量标记位点并呈孟德尔遗传等优点［１１］，能够检测亲缘关系非常近的材料之间的差异，因而在水生动物方面广泛用于遗传多样性分析、遗传图谱构建等研究［１２－１３］。本试验利用筛选的４对ＡＦＬＰ引物对日本青森县、大连长海县和大连旅顺口区３个光棘球海胆的野生群体进行遗传多样性分析。

１　材料与方法

１．１　试验材料

试验 所 用 的 光 棘 球 海 胆 日 本 青 森 县 群 体（ＱＳ），于２００８年４月取自日本青森县，大连长海县群体（ＣＨ），于２００８年１月取自大连长海县，大连旅顺群体（ＬＳ），于２００７年１０月取自大连旅顺口区。用剪刀沿口器周围剪开，取口器，用解剖刀刮取肌肉，７５％酒精保存于－２０℃冰箱备用。

１．２　基因组ＤＮＡ提取及检测

日本青森县群体和大连旅顺群体各取５０个个体，大连长海县群体取４３个个体，这些个体的基因组ＤＮＡ的提取参照《分子克隆实验指南》［１４］，略作改动。采用１％的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的ＤＮＡ，ＩＭＰＬＥＮ　Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ核酸蛋白检测仪测定ＤＮＡ的 含 量 和 纯 度，－２０ ℃保 存，用 于ＡＦＬＰ试验。

１．３　ＡＦＬＰ分析

ＡＦＬＰ操作流程参照Ｖｏｓ等［１１］的程序并略加改动，以优化试验条件，确定ＡＦＬＰ的最佳反应体系。ＡＦＬＰ操作流程中所使用的酶和引物等试剂药品均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。取约２００ｎｇ基因组ＤＮＡ采用双酶切，分别在３７℃用ＥｃｏＲ　Ｉ和６５℃下用Ｍｓｅ　Ｉ各消化３ｈ；然后与ＥｃｏＲ　Ｉ和Ｍｓｅ　Ｉ接头在１６℃下连接过夜６５℃；１０ｍｉｎ使连接酶失活后进行预扩增；预扩增用含有１个选择性碱基的引物，并在１％的琼脂糖凝胶电泳检测，使其出现１００～１０００ｂｐ的Ｓｍｅａｒ带；将预扩增产物稀释２０倍后作为模板用含有３个选择性碱基的引物进行选扩增（接头及引物序列见表１）。扩增产物在４．５％的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行６０Ｗ恒功率高压电泳，电泳结果进行银染检测。标记由引物组合及阿拉伯数字按分子量由大到小进行命名。选择性扩增使用了８种ＥｃｏＲ　Ｉ引物和８种Ｍｓｅ　Ｉ引物共６４个引物组合，通过预试验，从这些组合中选取扩增带数目适中、分布均匀和多态性高的４对引物组合，分别是Ｅ３８Ｍ６１（Ｅ００－ＡＣＴ，Ｍ００－ＣＴＧ）、Ｅ３９Ｍ５０（Ｅ００－ＡＧＡ，Ｍ００－ＣＡＴ）、Ｅ４４Ｍ５０（Ｅ００－ＡＴＣ，Ｍ００－ＣＡＴ）和Ｅ３２Ｍ４８（Ｅ００－ＡＡＣ，Ｍ００－ＣＡＣ）。

１．４　数据处理

银染之后得到的带谱，利用ＡＦＬＰ分析软件Ｃｒｏｓｓ　Ｃｈｅｃｋｅｒ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．９［１５］进行分析。有带记为１，无带记为０，获得０、１矩阵。统计计算群体内的多态 位 点 比 例 （Ｐ ＝多 态 位 点 数／位 点 总 数×１００％），以及利用ＰｏｐＧｅｎ３２软件计算Ｎｅｉ’ｓ基因多样性［１６］、Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数［１７］、群体间遗传相似度及遗传距离［１８］。根据个体间的遗传距离矩阵，采用ＰＨＹＬＩＰ３．６９［１９］的ＮＥＩＧＨＢＯＲ程序以ＵＰ－ＧＭＡ的方法对所有个体聚类。

２　结果与分析

２．１　３个地理亚群的ＡＦＬＰ扩增结果

应用４对引物组合从３个群体中共得到２３１个扩增位点，大小为５０～１０００ｂｐ（表２）。各引物组合得到的扩增位点分别为：Ｅ３８Ｍ６１得到６５个，Ｅ３９Ｍ５０得到６３个，Ｅ４４Ｍ５０得到６７个，Ｅ３２Ｍ４８得到３６个，多态位点总数１６８个，总的多态位点比例为７２．７３％，平均每个引物组合扩增出多态性位点数目为４２个，表明ＡＦＬＰ技术可以产生丰富的多态性条带，同时，本研究所应用的４对引物组合均可产生较多 的多态性 条 带 （表２）。引 物 组 合Ｅ３２Ｍ４８对３个群体的扩增谱带见图１。

２．２　３个地理亚群的遗传多样性分析

３个群体内的Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数和Ｓｈａｎ－ｎｏｎ多样性指数及相关遗传参数见表３。从Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数来看，大 连长海县群体 最大，为０．３０２０±０．１９２５，其次为大连旅顺群体０．２９９５±０．１９７７，日本青森县群体的最小０．２９４５±０．１９３５；群体内的Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数与Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数的变化趋势相同，从大到小依次为大连长海县群体０．４３９０±０．２７６７、大连旅顺群体０．４３４４±０．２８２０、日本青森县群体０．４２９８±０．２７６６。大连长海县群体在多态位点比例、Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数、Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数等参数略高于其他两个群体。群体内总的遗传变异值为０．３０５７±０．０３８４；群体内的遗传分化系数为０．２９８７±０．０３６６；群体间的遗传分化系数为０．０２３０，明显小于群体内的遗传分化系数，说明群体内的遗传多样性比较丰富。

２．３　遗传距离及聚类分析

光棘球海胆３个群体间的遗传距离和遗传相似度见表４（对角线以上是遗传相似度，对角线以下是遗传距离）。由表４可见，３个群体之间的遗传距离没 有 较 大 的 差 异，分 别 为０．０１０４、０．０１０７和０．０１０６；遗传相似度也基本一致，分别为０．９８９７、０．９８９３和０．９８９４。这个结果与地理位置的远近形成明显的对比，说明３个群体间未因地理隔离而产生明显的遗传分化。根据４对引物的扩增结果和群体间遗传距离矩阵，用ＰＨＹＬＩＰ　３．６９软件以ＵＰＧＭＡ方法对３个群体的１４３个个体进行聚类，聚类结果见图２。由图２可见，在最初的两个分支中，下面的分支中ＣＨ群体的１５个个体聚在一起，ＬＳ群体的ＬＳ１４和ＱＳ群体的ＱＳ１１聚在一起，另外有ＬＳ群体的ＬＳ４４和ＬＳ４６，ＱＳ群体的ＱＳ７聚类在此分支中；而上面的分支中３个群体的个体混杂在一起，没有明显的聚类规律。通过分析上述结果表明：３个群体间没有因为地理隔离而产生明显的遗传分化，３个群体间具有很高的遗传相似度。因此，尽管３个群体内的遗传多样性较为丰富，但群体间的地理分化特征并不明显。
３　讨论

本研究采用ＡＦＬＰ技术，通过４对引物对光棘球海胆的３个地理亚群进行了遗传分析，共得到２３１个扩增位点，其中１６８个多态位点，总的多态位点比例为７２．７３％，表明ＡＦＬＰ技术可以产生丰富的多态性条带；同时，本研究发现大连长海县群体的遗传多样性最丰富，多态位点比例、Ｎｅｉ’ｓ基因多样性指数、Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数等参数都高于其他两个群体，表明ＡＦＬＰ技术可以同时用于群体间遗传差异的比较和群体内个体的遗传组成情况分析。群体内的遗传分化系数为０．２９８７±０．０３６６，而群体间的遗传分化系数为０．０２３０，明显小于群体内的遗传分化系数，说明群体内的遗传多样性比较丰富。本研究的３个群体均为野生群体，并且光棘球海胆目前增殖放流史很短，规模不大，因而避免了近亲交配等因素对群体遗传多样性的不利影响，遗传结构多样性保存完好，蕴藏着比较丰富的育种潜力。

从遗传距离和群体聚类分析上来看，３个群体之间的遗传距离没有较大的差异，３个群体的１４３个个体之间没有形成明显的聚类分支，而是混杂在一起，说明３个群体间没有因为地理隔离而产生明显的遗传分化，３个群体间具有很高的遗传相似度。因此，３个群体内的遗传多样性较为丰富，群体间的地理分化特征并不明显。造成这种结果的主要原因可能是３个地理亚群所处的地理环境比较相似，特别是在温度和盐度两个对海胆的生长发育起关键作用的环境因子的差异不大，因而不同的地理位置对光棘球海胆的生长和发育所产生的影响不足以形成生殖隔离，因而３个地理亚群之间的地理分化特征并不明显。