论文：双斑东方鲀与红鳍东方鲀杂交育种研究初报

双斑东方鲀与红鳍东方鲀杂交育种研究初报

钟建兴，李雷斌，刘波，方民杰，郑惠东

(福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013)

为获得具有杂交优势东方鲀苗种，开展了双斑东方鲀与红鳍东方鲀杂交组、对照组人工繁殖及育苗；正交组(SH)、反交组(HS)胚胎发育观察；杂交组、对照组幼鱼耐高温试验。结果表明：正交组、反交组、双斑东方鲀子一代对照组(SB)、红鳍东方鲀子一代对照组(HQ)卵受精率分别为95.6%、93.5%、96.0%、89.5%，受精卵孵化率分别为92.2%、80.6%、89.4%、79.9%，室内育苗成活率分别为28.4%、18.7%、27.5%、19.2%；正交组(SH)池塘生态培育成活率为18.3%；在18.0～20.0℃水温条件下，正交组(SH)受精卵经132 h孵出仔鱼，反交组(HS)受精卵经164 h40 min孵出仔鱼；在28.0～35.0℃水温条件，反交组(HS)、对照组(HQ)幼鱼不能存活，正交组(SH)、对照组(SB)幼鱼正常生长；杂交子代生物学特性与母本相近，正交组(SH)可在福建、广东、海南等南方沿海地区推广养殖。

双斑东方鲀；红鳍东方鲀；杂交；育种

双斑东方鲀(Fugubimaculatus)、红鳍东方鲀(Fugurubripes)同属鲀形目(Tetraodontiformes)、鲀科(Tetraodontidae)、东方鲀属(Fugu)[1]。双斑东方鲀分布于南海、东海和黄海南部，为我国南方沿海东方鲀主要养殖种类；背鳍12～14，臀鳍11～13，胸鳍16～17，尾鳍10；体背侧面具十余条深褐色弧形横纹，最后两条与背缘平行延向尾基；腹面乳白色，胸鳍后上方体侧具一白边黑斑，背鳍基底白色并具白边黑斑，胸鳍基底两侧各有一小黑斑；适宜水温为13～36℃，最适水温为18～30℃；个体小、生长较慢。红鳍东方鲀分布于北太平洋西部的日本、朝鲜半岛和中国沿海，为我国北方沿海东方鲀主要养殖种类；背鳍17，臀鳍15，胸鳍15～17，尾鳍10；背面和上侧面青黑色，腹面白色；体侧在胸鳍后上方有一白边黑色大斑，斑的前方、下方及后方有小黑斑，臀鳍白色，其余各鳍黑色；适宜水温为15～28℃，最适水温为16～23℃，致死低温为7℃；水温降至12℃，摄食减少，9℃以下，活动减弱，停止摄食；水温超过28℃，鱼体活动缓慢，抗病力减弱；个体大，生长快[2-4]。

杂交育种为传统重要遗传选育手段之一，子一代不仅可表现出亲本优良性状，而且能产生亲本未出现的优良性状，获得杂种优势，已广泛运用于水产生物的遗传选育和苗种生产：奥利亚罗非鱼(Oreochromiscoaureus)♀×尼罗罗非鱼(Oreochromisconilotica)♂、美国条纹鲈(Moronesaxatilis)×白鲈(Lateolabraxjaponicus)正反交、红鳍东方鲀♀×黄鳍东方鲀(Takifuguxanthopterus)♂、豹纹东方鲀(Fugupardalis)♀×杂色东方鲀(Fugupoecilonotus)♂、大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)和细鳞麻哈鱼(Oncorhynchusgorbuscha)正反交、多须石首鱼(Pogoniascromis)♀×眼斑拟石首鱼(Sciaenopsocellatus)♂、鰤鱼(Seriolaquinqueradiata)♀×黄条鰤(Seriolaaureovittata)♂、棕点石斑鱼(Epinephelusfuscoguttatus)♀×鞍带石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)♂、云纹石斑鱼(Epinephelusmoara)♀×鞍带石斑鱼♂杂交子代在体型、体色生长速度、抗病力等性状优势明显[5-12]。作者于2005—2006年开展双斑东方鲀与菊黄东方鲀、双斑东方鲀与黄鳍东方鲀杂交试验，获得成功[13-18]，2010年开始进行双斑东方鲀与红鳍东方鲀杂交育种方面工作，取得初步结果，以期能为东方鲀遗传育种研究及苗种生产提供参考。

1　材料与方法

1.1实施地点及主要设施

试验在福建省海水鱼类苗种繁育科研中试基地开展。主要设施：蓄水池12 000 m2，沙滤池100 m2，水塔400 m3；生物饵料培育池15口，855 m2；室内育苗池20口，280 m2，生态培育池塘3口，6 003 m2；燃煤无压锅炉提温系统一套；规范实验室3间，100 m2。

1.2亲鱼来源及强化培育

亲鱼来源两个地域：红鳍东方鲀亲鱼购自山东省和河北省；双斑东方鲀来自福建省。2010年从山东省和河北省选购2～3冬龄红鳍东方鲀22尾，平均体重1 238.9 g；从基地池塘筛选人工养殖3冬龄双斑东方鲀70尾，平均体重588.2 g；2011年从山东省选购3冬龄红鳍东方鲀8尾，平均体重1 636.0 g；从福建南部海域选购3冬龄野生双斑东方鲀50尾，平均体重707.0 g。

亲鱼放于室内水泥池进行强化培育。圆形水泥池，水体5～20 m3；暂养密度为2.5～4.0 kg/m3；投喂冰鲜牡蛎(Ostreagigas)、蓝圆鯵(Decapterusmaruadsi)、玉筋鱼(Ammodytespersonatus)肉等，少量多次投喂；避免惊扰，保持环境安静；培育期间水温控制在18.0℃以上；使用40 W日光灯每天延长3～5 h光照。

1.3亲鱼人工催产、授精

正交组(Normal crosses，SH)：双斑东方鲀(♀)×红鳍东方鲀(♂)子一代；

反交组(Reciprocal crosses，HS)：红鳍东方鲀(♀)×双斑东方鲀(♂)子一代；

对照组(Control groups ，SB)：双斑东方鲀子一代；

对照组(Control groups ，HQ)：红鳍东方鲀子一代。

催产激素为地欧酮(DOM)、促黄体释放激素类似物(LRH)及绒毛膜促性腺激素(HCG)，由宁波第二激素厂生产。用5%葡萄糖注射液稀释配制。注射剂量：DOM2.0 mg 、LRH1.0 μg、HCG400 IU，雄鱼减半或不注射。催产激素单独或混合使用。注射时间：上午09：00～10：00；下午15：00～16：00。注射部位：胸腔、腹腔及背部肌肉。两种东方鲀属不同种，种间不能自行交配，必须进行人工授精。

1.4受精卵人工孵化

受精卵经多次清洗，集中置于0.5 m3孵化桶中孵化，孵化用水为砂滤海水，孵化密度为1～5个/mL，孵化前期增大充气，保证受精卵在水体中上下翻动；孵化后期逐渐调小充气量。及时去除泡沫、油膜，保持水质清新。孵化期间水温18.0～24.8℃，海水盐度21～30，pH为8.0～8.2 。

1.5杂交子代(F1)仔、稚、幼鱼培育

1.5.1仔鱼前期培育

仔鱼数量较多时，采用11、17 m3方形水泥池培育；仔鱼数量较少时，采用0.5 m3孵化桶培育。放养密度为1.0×104～5.7×104尾/m3。仔鱼孵出后第5天开口，口裂较大，直接投喂轮虫(Brachionusplicatilis)，密度为5～8个/mL，每天投喂2～3次；第10天投喂密度为8～10个/mL。轮虫投喂前用小球藻(Nannochloropsisoculata)或营养强化剂强化24 h。每日添加适量的小球藻以调节水色。每天加水或换水，保持水质清新。培育期间水温19.5～22.2℃，海水盐度23.0～28.0，pH为8.0～8.3。

1.5.2仔、稚、幼鱼后期培育

仔鱼经9～12 d精心培育后，全长3.4～4.8 mm，出池转入后期培育。

1)室内水泥池后期培育

培育池采用5 m3圆形水泥池、11 m3方形水泥池、17 m3方形水泥池，水深0.5～1.5 m。放养密度为0.1×104～0.2×104尾/m3。15 d开始投喂丰年虫(Artemiasalina)、蒙古裸腹蚤(Moinamongolina)，密度为0.1～0.2个/mL，轮虫密度降至5个/mL；25～30 d投喂鱼糜，每日4～5次，每次投喂时间为45～60 min；30 d开始投喂人工配合饲料。每5天进行生物学测定一次，随机抽样30尾。培育期间水温17.0～26.2℃，海水盐度18.0～28.0，pH8.0～8.3。

2)池塘生态培育

池塘3口，其中0.13 hm22口、0.33 hm21口。水深1.0～2.0 m，每池配备1.5 kW增氧机1台。放仔鱼前彻底清塘后，加水30 cm，漂白粉(25 kg/667m2)或生石灰(100 kg/667m2)带水消毒。确定消毒有效后，进水(100目筛绢过滤)1.0 m左右，进行生物饵料培养(肥水)。放养密度为110×104～120×104尾/hm2。培育前期，仔鱼主要摄食池中的天然生物饵料；放养15 d后开始驯化人工饲料。人工饲料包括冰冻玉筋鱼肉糜(块)和人工配合饲料。配合饲料为浮性颗粒，粗蛋白含量为45%～50%。鱼肉糜(块)与配合饲料相结合，每天投喂2～4次。日常管理主要包括水质调控、巡塘、生物学测定等。

1.6杂交组胚胎发育观察

取刚完成人工授精及人工孵化过程中受精卵，连续观察、记录、拍照。使用Leica显微镜(XSP-EMED)和解剖镜(XTL-2400)观察正反交组受精卵胚胎发育时序、胚胎发育特征；使用Nikon(COOLPIXs8100)数码照相机拍照。

1.7杂交组、对照组耐高温试验

在基地1口0.5 hm2池塘搭设固定式网箱4口，网箱规格3 m×3 m×1.2 m，每口网箱设气石1个，24 h充气增氧。2011年7月3日每口网箱分别放养平均全长5.6 cm正交组、5.2 cm反交组、4.6 cm对照组(SB)、3.8 cm对照组(HQ)幼鱼500尾，试验期 30 d。每天投喂配合饲料2次，上下午各测水温1次。试验期间水温28.0～35.0℃，海水盐度28.0～30.0。

2　结果

2.1亲鱼人工催产与产卵

2010—2011年正交组、反交组、对照组亲鱼经人工催产，产卵结果见表1。正交组19尾获产，共产卵4 372.0 g，平均受精率95.6%；反交组2尾获产，共产卵88.3g，平均受精率93.5%；对照组(SB)2尾获产，共产卵411.7 g，平均受精率96.0%；对照组(HQ)2尾获产，共产卵71.5 g，平均受精率89.5%。

表1　2010—2011年杂交组、对照组催产结果

续表1

2.2受精卵人工孵化

2010—2011年正交组、反交组、对照组受精卵经人工孵化，结果见表2。正交组共孵出仔鱼372.3×104尾，平均孵化率92.2%；反交组共孵出仔鱼4.3×104尾，平均孵化率80.6%；对照组(SB)共孵出仔鱼33.7×104尾，平均孵化率89.4%；对照组(HQ)共孵出仔鱼4.1×104尾，平均孵化率79.9%。

表2　2010—2011年杂交组、对照组受精卵孵化结果

2.3仔鱼前期培育

2010—2011年正交组、反交组、对照组孵出仔鱼经9～12 d前期培育，结果见表3。正交组共培育出后期仔鱼347.0×104尾，平均成活率91.5%；反交组共培育出后期仔鱼3.8×104尾，平均成活率88.0%；对照组(SB)共培育出后期仔鱼29.5×104尾，平均成活率87.5%；对照组(HQ)共培育出后期仔鱼2.7×104尾，平均成活率84.4%。

表3　2010—2011年杂交组、对照组仔鱼室内前期培育结果

2.4仔、稚、幼鱼后期培育

2.4.1室内水泥池后期培育

正交组、反交组、对照组孵出仔鱼在室内水泥池培育至60 d，生长结果见图1。正交组培育出平均全长35.8 mm幼鱼4 189尾，育苗成活率28.4%；反交组培育出平均全长49.6 mm幼鱼1 868尾，育苗成活率18.7%；对照组(SB)培育出平均全长27.7 mm幼鱼3 256尾，育苗成活率27.5%；对照组(HQ)培育出平均全长46.4 mm幼鱼3 673尾，育苗成活率19.2%。

2.4.2池塘生态培育

2010—2011年正交组孵出仔鱼在室外池塘生态培育至60 d，生长结果见表4。共培育出44.4 mm幼鱼12.3×104尾，平均成活率18.3%。与室内池培育比较，池塘生态培育的鱼苗生长快、成活率低。

表4　正交组池塘、室内池培育仔稚幼鱼生长测定

2.5正交组、反交组胚胎发育

正反交组受精卵近圆形，淡黄色，卵膜较厚不透明，内有大小不一油球组成的油球囊一个，属沉性黏性卵。正交组受精卵较小，卵径1.00～1.08 mm，950粒/g；反交组受精卵较大，卵径1.04～1.20 mm，700粒/g。

正交组受精卵孵化期较短，在海水水温18.0～20.0℃条件下，2 h50 min开始卵裂，19 h35 min囊胚期，27 h15 min原肠期，51 h10 min胚体期，132 h孵出仔鱼(图2)；反交组受精卵孵化期较长，在海水水温18.0～20.0℃条件下，3 h40 min开始卵裂，19 h25 min囊胚期，25 h20 min原肠期，61 h40 min胚体期，164 h40 min孵出仔鱼(图3)。

2.6杂交组、对照组耐高温能力

杂交组、对照组耐高温试验结果如表5。对照组(HQ)幼鱼放入网箱，摄食量逐渐减少，7 d后基本不摄食，鱼体消瘦，开始死亡；11 d全部死亡。反交组幼鱼放养网箱，15 d后摄食开始减少，鱼体消瘦；20 d开始死亡；25 d全部死亡。对照组(SB)、正交组幼鱼摄食、生长、成活率正常。

表5　杂交组、对照组子代(F1)幼鱼耐高温试验结果

3　讨论

东方鲀属春季一次性产卵鱼类，产卵期短。由于地理分布差异，从山东省和河北省购进的红鳍东方鲀比福建本地双斑东方鲀性成熟时间推迟约20 d，为保证两种东方鲀杂交成功，必须对其性成熟时间进行调控，使之同步。本试验提前1个月将红鳍东方鲀移入室内水泥池饲养，采用锅炉加热提高水温(20℃)、延长日光照时间(5 h)、加强饵料营养(投喂鲜牡蛎肉、虾肉等，并添加一定量维生素E)、注射外源激素(每2～3天背鳍基部注射DOM一次，剂量为1.0 mg/kg)等方法加快红鳍东方鲀性成熟速度。催产结果表明，两种东方鲀性成熟时间同步调控有效。

1.受精卵；2.卵膜举起；3.2细胞期；4.4细胞期；5.8细胞期；6.64细胞；7.多细胞期；8.桑椹期；9.高囊胚；10.低囊胚；11.原肠初期；12.原肠中期；13.原肠后期；14.眼泡形成期；15.体节形成期；16.心跳出现期；17.色素形成期；18.晶体形成期；19.出膜期；20.孵出期。

1.Feitilized egg；2.Membrane lift；3.2-cell stage；4.4-cell stage；5.8-cell stage；6.64-cell stage；7.Multi-cell stage；8.Morula stage ；9.Early blastula stage ；10.Late blastula stage；11.Early gastrula stage；12.Mid gastrula stage ；13.Late gastrula stag；14.Optic vesicle stage；15.Myotome formation stage；16.Heart pulsation stage；17.Pigment formation stage；18.Crystal formation stage；19.Early hatching stage；20.Hatching-out stage.

1.受精卵；2.卵膜举起；3.2细胞期；4.4细胞期；5.8细胞期；6.64细胞；7.多细胞期；8.桑椹期；9.高囊胚；10.低囊胚；11.原肠初期；12.原肠中期；13.原肠后期；14.眼泡形成期；15.体节形成期；16.心跳出现期；17.色素形成期；18.晶体形成期；19.出膜期；20.孵出期。

一般来说，分布地区距离较远，外部形态特征差异较大，基因型纯化程度较高的种间杂交出现杂交优势的可能性较高[19]。双斑东方鲀为南方养殖种类，红鳍东方鲀为北方养殖种类，两种鲀地理隔离较远；双斑东方鲀属小型种类、生长速度较慢，红鳍东方鲀属大型种类、生长速度较快，两类生物学特性差异较大。在两个东方鲀群体亲本纯化的基础上，筛选足够数量的繁殖亲本进行杂交可能获得具有生长速度、抗病能力强、扩大适温或盐度范围等优良性状的杂交优势。根据试验结果，正交组、反交组、对照组(SB)、对照组(HQ)60 d幼鱼平均全长分别为35.8、49.6、27.7、46.4 mm，正交组大于对照组(SB)，反交组大于对照组(HQ)，杂交组呈现生长速度较快的优势。

双斑东方鲀与红鳍东方鲀为东方鲀属不同种类，其杂交属种间杂交，亲缘关系较远。本试验正交组卵的受精率、受精卵孵化率、仔稚幼鱼培育成活率等指标与对照组无明显差异，表明双斑东方鲀与红鳍东方鲀种间杂交育种是可行的，且可进行规模化育苗，应用于生产。

正交组受精卵孵化率为92.2%，略高于对照组(SB)89.4%；反交组受精卵孵化率为80.6%，略高于对照组(HQ)79.9%。这一结果与吴水清等[12]、杨求华等[20]报道的石斑鱼杂交受精卵孵化率略低于对照组结果相反，初步判断双斑东方鲀与红鳍东方鲀杂交组胚胎发育，与石斑鱼的卵裂期和囊胚期受影响不同，其受精卵胚胎发育各期皆能正常发育。

对东方鲀杂交苗种的养殖意义评价，除生长速度重要指标外，能否适应本地气候条件更不可忽视。本试验结果，正交组、反交组皆表现出生长优势，但耐温能力差异较大：正交组可适应高水温环境，反交组则不能存活。由此得出，正交组继承母本耐高温基因的同时，从父本获得生长速度快基因，可在福建、广东、海南等南方沿海地区夏季推广养殖；反交组虽然获得生长优势，但继承母本不耐高温基因，在南方无养殖价值。进一步的养成试验证明，正交组不仅适合福建省全年气候条件，且生长优势明显。

正反交组胚胎发育、仔稚幼鱼发育生长、耐温能力等特性与母本相近，这一结果与菊黄东方鲀和双斑东方鲀杂交、黄鳍东方鲀和双斑东方鲀杂交结果相似[17-18]。

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