方斑东风螺“翻背症”的病原及初步治疗研究

方斑东风螺“翻背症”的病原及初步治疗研究

赵 旺1,2，吴开畅1,2，王江勇1,2，凌 慧1,2，杨 蕊3，岑小勇4，叶 乐1,2

( 1. 中国水产科学研究院 南海水产研究所，热带水产研究开发中心，海南 三亚 572018；2. 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300；3. 三亚意源养殖有限公司，海南 三亚 572000； 4. 万宁市水产技术推广站，海南 万宁 571500 )

对海南发生“翻背症”的方斑东风螺进行了病原分离、鉴定，药敏分析及药物治疗试验。结果显示，病原为哈维弧菌，该菌对喹诺酮类、磺胺类药物敏感，对青霉素、阿莫西林等耐药；药物治疗结果显示，试验组诺氟沙星、复方磺胺甲恶唑、苯扎溴铵及对照组的最终存活率分别为39.05%、32.38%、29.52%和14.29%，诺氟沙星的治疗效果较好，可用于治疗方斑东风螺“翻背症”。

方斑东风螺；翻背症；哈维弧菌；药物治疗

方斑东风螺(Babyloniaareolata)属腹足纲、腹足目、蛾螺科、东风螺属，在中国主要分布于福建、广东、广西和海南等地。东风螺肉质鲜美、营养丰富，是中国东南沿海重要的经济养殖贝类。随着东风螺养殖规模的扩大，各种爆发性病害频发，已威胁到东风螺养殖业的发展。目前已报道的主要病原有：有害寄生性动物[1-3]、细菌[4-6]和其他病原[7-8]，其中细菌性病害最为常见。近年来海南多个东风螺养殖场陆续爆发的“翻背症”(亦称“急性死亡症”)，该病症状与“肿吻症”类似，发病时东风螺活力很差，螺体仰翻于沙面上，不能钻沙；腹足表面积累较多黑色杂质，足肌边缘收缩内卷呈波纹状，足部全伸或半伸出螺壳，用物刺激仅能部分缩回壳中；与肿吻症明显不同的是病螺吻管并无水肿、伸出等病症；该病发病快，初期少量螺表现出该症状后2～3 d迅速爆发至全池甚至全养殖场，且其死亡率可达80%以上。目前，东风螺细菌性病害治疗，多为病原对药物的敏感性分析[9-10]，进一步治疗效果的报道较少。笔者对方斑东风螺“翻背症”的病原进行了分离与鉴定，针对生产上养殖户习惯使用化学消毒剂和抗生素甚至是水产禁用药物治疗东风螺疾病的现象，探索了几种水产常用药物的治疗效果，以期为东风螺“翻背症”的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用螺：患病方斑东风螺采于海南省万宁某东风螺养殖场，为发生“翻背症”初期的稚螺，单粒体质量(1.35±0.49) g。感染用螺取自海南省三亚市某东风螺养殖基地，暂养期间状态良好，单粒体质量(1.31±0.45) g。

主要试验药物与试剂：营养琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养基、硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)，药敏分析纸片(杭州天和微生物试剂有限公司)，Bacterial DNA kit(Omega公司)，PCR反应套装(Takara公司)；根据病原药敏分析结果及养殖户用药习惯选取的治疗药物：复方磺胺甲恶唑(广东台城制药股份有限公司)、呋喃西林(南昌白云药业有限公司)、苯扎溴铵(广州精博生物技术有限公司)和诺氟沙星(广州精博生物技术有限公司)。

试验用暂养容器为聚乙烯框(68 cm×42 cm×18 cm)，框底铺厚3 cm、粒径1～3 mm的消毒河沙，试验用沙滤海水。

1.2 优势菌的分离培养

无菌条件下，取发病初期症状典型病螺的足肌、鳃、外套膜、内脏等组织匀浆，无菌生理盐水稀释涂布于营养琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养基、硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖琼脂培养基，28 ℃恒温培养48 h后，分离纯化形态一致的优势菌落，供人工感染与鉴定。

1.3 人工感染

将纯培养优势菌株接种于营养琼脂斜面，28 ℃培养24 h，用无菌生理盐水洗脱菌苔制成菌悬液，平板培养法测定活菌密度；将菌液10倍梯度连续稀释后，对健康东风螺进行肌肉注射，每个菌液梯度注射2组，每组10粒，每粒菌液剂量0.1 mL，另设对照组注射无菌生理盐水。人工感染后记录螺死亡情况，连续记录7 d。采用 Karber 法计算菌株的半数致死剂量(LD50)[11]。整个试验期间，水温(28±1) ℃，盐度30±1，pH 8.0±0.2，溶解氧>6 mg/L。

1.4 病原菌的16 S rDNA鉴定

使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌的总DNA，以总DNA 为模板，用细菌通用引物对8F/1492R进行PCR 扩增。反应体系与反应条件参照相关文献[12]进行。PCR反应产物由Invitrogen公司测序，将测序结果与NCBI GenBank 数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中已报道的序列进行相似性比较，确定该病原菌的种属。

1.5 药敏分析

采用药敏纸片法进行，将不同药物的药敏纸片贴于涂满病原菌的平板上，28 ℃培养24 h后记录各药敏纸片的抑菌圈直径，并根据药敏纸片抑菌范围解释标准判断药敏性。

1.6 药物治疗试验

取“翻背症”初期具明显症状的东风螺1批随机分配到试验框中，每框放置35 粒。每种药物设3个质量浓度，每个质量浓度3个平行，每日药浴约18 h，流水6 h，不投饵料。试验组复方磺胺甲恶唑质量浓度分别为2、4 mg/L和6 mg/L；苯扎溴铵质量浓度分别为0.1、0.2 mg/L和0.3 mg/L；诺氟沙星质量浓度分别为1、2 mg/L和3 mg/L；呋喃西林质量浓度分别为3、6 mg/L和9 mg/L；另设对照。每日检查并记录死亡情况，刺激无反应即判断为死亡。

根据每日各试验组的死亡情况计算每日存活率：

存活率/%=(试验螺总数-死亡螺总数)/试验螺总数×100%

用SPSS 19.0对各试验组的最终存活率进行分析，用F检验差异显著性，LSD法进行多重比较。整个试验期间海水溶解氧7～8 mg/L，水温27～28.5 ℃，pH 8.0±0.1，盐度28～33，试验周期17 d。

2 结果与分析

2.1 翻背症病螺症状

正常螺昼伏夜出，白天很少在沙面上活动；螺体背腹面颠倒后能通过足肌旋转迅速翻转过来(图1a)。“翻背症”病螺活力很差，体表黏液减少；背腹面颠倒，壳口朝上，不能自行翻转；足肌伸缩无力，对刺激不敏感；足部边缘收缩呈波纹状，部分病螺腹足因表面积累异物呈黑色(图1b)。人工感染后，健康螺表现出与“翻背症”相同症状(图1c)。

图1 方斑东风螺a.正常螺；b. “翻背症”螺；c. 人工感染螺.

2.2 优势菌的分离

将“翻背症”方斑东风螺组织匀浆液稀释涂布于营养琼脂培养基、脑心浸液琼脂培养基和硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖琼脂培养基上，分别分离到3株优势菌F1、F2和F3，其中F1含量占平板总细菌量的85%，F2为80%，F3超过80%；这3株菌在营养琼脂平板上表现出相同的特点：淡黄色、圆形、不透明、边缘光滑、湿润、直径2～3 mm，在脑心浸液琼脂培养基上呈现灰白色、圆形、不透明、边缘光滑、湿润、直径1.5～3 mm，在硫代硫酸盐—柠檬酸盐—胆盐—蔗糖培养平板上呈现黄色、圆形、不透明、边缘光滑、湿润、直径1.5～3 mm。

2.3 优势菌的人工感染结果

优势菌F1、F2和F3分别人工感染后，东风螺均出现与“翻背症”相同的症状(图1c)，累计死亡结果见表1，半数致死剂量分别为：7.01×106cfu/g、6.13×106cfu/g、7.43×106cfu/g。

表1 东风螺“翻背症”优势菌的人工感染结果

2.4 病原菌的16 S rDNA鉴定

菌株F1、F2、F3及人工感染后分离的优势菌株经PCR扩增16S rDNA获得大小约1500 bp的片段，产物测序、比对后显示，3株优势菌及人工感染后分离的优势菌株与哈维弧菌(Vibrioharveyi)相似度高于99%，可确定病原菌为哈维弧菌。

2.5 病原菌的药敏分析

药物敏感性试验结果显示，病原菌对土霉素、复方新诺明、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、四环素等敏感，对卡那霉素、利福平、新霉素、庆大霉素等中度敏感，对头孢氨苄、阿莫西林、青霉素等表现为耐药。

2.6 患“翻背症”方斑东风螺药浴的每日存活率

各试验组每日存活率曲线呈现先急剧下降后逐渐平缓的变化趋势(图2)。由图2可见，前3 d，药物治疗组和对照组存活率下降都很快，说明发生“翻背症”的东风螺死亡率高且死亡迅速；药物治疗组3 d后的存活率不到60%，而未采取任何药物治疗措施的对照组存活率约30%，可见若未及时采取治疗措施，损失将十分巨大。

另外，对照组与大部分药物治疗组在第1 d存活率就存在较大差别，大部分药物治疗组第1 d存活率约70%，而对照组存活率仅为55.2%，说明这些药物有一定的治疗效果，并且用药越早越好。

2.7 患“翻背症”方斑东风螺药物治疗的最终存活率

从试验各组的最终存活率结果可知，对照组东风螺的平均存活率不到20%；呋喃西林和诺氟沙星治疗的存活率显著高于对照组(P<0.05)，且不同药物质量浓度的治疗效果存在差异，其中以2 mg/L诺氟沙星和3 mg/L呋喃西林效果最佳，平均存活率约40%，两者治疗的最终存活率无明显差异(P>0.05)；而复方磺胺甲恶唑片和苯扎溴铵效果稍差，平均存活率低于35%(图3)。

图2 药浴试验各组的每日存活率变化

图3 药浴试验各组最终存活率

3 讨 论

3.1 东风螺细菌性病害的病原分析

“翻背症”与“肿吻症”是东风螺工厂化养殖过程中常见的细菌性病害。目前已报道“肿吻症”的病原有鳗弧菌生物变种Ⅰ(V.anguillarumBiovar Ⅰ)[6]和哈维弧菌[5,13-14]，同时该病的发生、发展与水体环境中异养菌的数量及体内条件致病菌的感染程度密切相关[15]；研究发现，本次海南万宁地区东风螺“翻背症”的病原也为哈维弧菌，症状与“肿吻症”存在明显差异“翻背症”病螺不出现吻管外伸、肿大、局部发红等现象。相同宿主感染哈维弧菌却表现出不同的症状，这可能与宿主生活的环境、生理状态及病原的感染途径等有关。

3.2 东风螺“翻背症”的药物治疗效果分析

对东风螺“翻背症”病原哈维弧菌的药敏分析显示，该病菌对磺胺类、喹诺酮类药物等药物敏感，这与曾德乾等[16]调查海南、广东等地哈维弧菌的抗生素敏感性一致，因此考虑用这些病原菌敏感的药物进行治疗试验。试验结果显示，诺氟沙星与呋喃西林治疗的效果最佳，呋喃西林作为水产养殖禁药不能用于治疗，而诺氟沙星是一种抗菌谱广、抗菌作用强、在养殖动物体内代谢快、休药期短、药效稳定的喹诺酮类抗菌药物，可用于治疗多种常见淡水鱼疾病如细菌性败血病、肠炎病、烂鳃病、竖鳞病、白头白嘴病、打印病、赤皮病等[17-18]，这些都提示在生产上发生由哈维弧菌引起的东风螺“翻背症”时可以使用诺氟沙星替代呋喃西林来治疗。

急性毒性试验结果表明，方斑东风螺稚螺对苯扎溴铵较为敏感，药物安全质量浓度为0.58 mg/L，仅高于生产厂家推荐用量(0.1 mg/L)数倍[19]。本试验发现，0.1、0.2 mg/L和0.3 mg/L苯扎溴铵的治疗存活率分别为29.52%、23.81%和17.14%，即随着药物质量浓度的升高存活率反而降低，这说明与正常东风螺相比，发生“翻背症”的东风螺对苯扎溴铵更敏感。因此，东风螺养殖中尤其是病害发生时应谨慎使用苯扎溴铵。

3.3 东风螺“翻背症”的防治措施

“翻背症”爆发快、传染性强、死亡率高，给东风螺养殖业带来沉重的打击。针对其主要病原哈维弧菌的药敏试验显示，该病原对磺胺类和喹诺酮类药物敏感，治疗结果表明，“翻背症”发生后3 d内东风螺死亡率最高，治疗效果最佳为呋喃西林和诺氟沙星，发病群体存活率约40%。因此，发生“翻背症”时可以使用诺氟沙星来治疗。同时，也发现这几种药物治疗“翻背症”的效果比较有限，推测其原因可能是：药物较难透过螺壳作用于软体部分；东风螺长时间在沙层中生活，药物难以透过沙层而杀灭环境中的病原菌；病原菌给东风螺软体造成难以恢复的损伤，导致其死亡。另外，高质量浓度的苯扎溴铵治疗效果比低质量浓度的差，这说明病害发生时，滥用药物是造成东风螺死亡严重的重要原因。因此，东风螺病害的防治重点还在于预防。在养殖过程中可采取各种措施改善养殖条件，提高东风螺自身抵抗力水平；及时清理养殖底沙中的残饵残渣，定期消毒养殖底沙，破坏细菌滋生的温床；养殖用品消毒，防止交叉感染；与其他养殖动植物混养、施加益生菌等，营造一个相对复杂而稳定的养殖生态系统，是预防东风螺“翻背症”的重要途径。