石斑鱼循环水养殖系统与自然海水水质和细菌数量比较分析

        石斑鱼循环水养殖系统与自然海水水质和细菌数量比较分析

吴永丽，吴桂仪，马细兰，周立斌*，孙恺辉

（1.惠州学院，广东 惠州 516007；2.广东白鹤生物科技发展有限公司，广东 深圳 518120）

循环水养殖系统是一种新型的养殖模式，也称工厂化循环水养殖系统，其原理为养殖尾水通过水处理设备净化处理后再循环利用。相比传统的养殖模式，循环水养殖模式能减少养殖过程对周边水环境依赖，减少养殖过程中污水排放，提高养殖生物成活率，提高产量和品质，降低养殖风险，实现绿色养殖，对水产养殖业健康和可持续发展具有重要意义，其市场前景十分广阔。近年来，由于养殖生物病害的频繁发生和严重的水环境污染，我国的水产养殖业面临巨大的压力，产量也持续走低。研究表明，严重影响我国水产养殖业发展的主要原因，是养殖水体微生物生态环境恶化，其防治方法是维持良好的养殖水体生态环境[1-3]。因此，加强对循环养殖系统中细菌组成及数量研究，具有重要意义。

细菌与其他生物及环境条件一同构成水体生态系统，细菌是循环养殖生态系统的重要组成部分，它可通过直接参与物质循环和能量流动，进而影响整个养殖环境的水质状况[4]。目前，有关对虾养殖环境中细菌组成和数量的研究比较深入[5-9]。有关对滩涂海水种植-养殖系统[10]、凡纳滨对虾低盐度高产虾池环境[11]、盐碱地养虾池塘[12]中的细菌组成和数量变化的研究报道较多，但对石斑鱼循环养殖系统中细菌组成方面的研究甚少。石斑鱼味道鲜美、营养丰富，深受消费者的喜爱，是一种具有很高经济价值的食用鱼类。为比较石斑鱼循环水养殖系统与自然海水水质和细菌数量，对其养殖水体的环境因子进行检测，对异养细菌、弧菌、大肠菌群、硫酸盐还原菌和氨化细菌进行分离培养和生物量的计算，以获得基础数据，拟为石斑鱼循环养殖系统的健康持续发展以及养殖水体微生物系统的改良调控和疾病防治，提供参考。

1 材料与方法

1.1 养殖系统与样品采集

试验水样采自广东省海洋渔业试验中心石斑鱼循环水养殖系统的出水口。共有3类不同的循环水养殖系统，其中A1和A2为一类养殖系统，各自有3个养殖池；B1和B2为另一类系统，各有6个养殖池；此外，C1、C2和C3是第3类系统，各有3个养殖池。于上午投喂4 h后，分别从A1、A2、B1、B2、C1、C2和C3系统每个养殖池出水口处采集水样5 000 mL，每个水样3个重复。对照组为大亚湾的自然海水。

1.2 环境因子的测定

采用水质测定仪现场检测温度、盐度、pH值、溶解氧，靛酚蓝分光光度法测定氨氮，萘乙二胺分光光度法测定亚硝酸盐氮，具体检测方法参照《海洋监测规范》（GB 17378.4—2007）。将3次样品的平均值作为采样点的水质理化参数。

1.3 水体细菌数量的测定

检测3类养殖系统和自然海水中的异养细菌、弧菌、大肠菌群、氨化细菌及硫酸盐还原菌5类细菌的数量。利用平板计数琼脂培养基，对水体异养细菌总数进行测定，弧菌数量测定采用TCBS培养法，大肠菌群培养采用伊红美蓝琼脂培养基培养，配制蛋白胨氨化培养基（含琼脂）用于氨化细菌的测定与培养，制备的硫酸盐还原菌培养基用于硫酸盐还原菌的培养与计数。取备好的样品分别用无菌海水做梯度稀释至10-1、10-2、10-3，各稀释梯度均取100 μL进行涂布平板，每个梯度分别做3个平行，将接种后的平板置于28℃恒温培养箱中培养24~36 h，然后采用平板计数法计数，计数菌落形成单位数（Colony Forming Units,CFU）。

1.4 数据统计分析

环境因子（温度、盐度、pH值、溶解氧、氨氮，亚硝酸盐氮）及细菌数量的比较用Spass的t检验，当P＜0.05时表示差异显著。采用Graphpad 6.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 环境因子的变化特征

循环水养殖系统和自然海水水质理化指标测定结果见图1（a）（b）（c）。由图1（a）可见，各类水体的水温差异并不明显，均维持在27.6℃左右。除了B1系统中溶解氧质量浓度较低，为4.1 mg/L；其他循环水养殖系统和自然海水中的溶解氧含量较高，且较恒定[图1（a）]。各类循环水养殖系统的盐度差异较小，为3.13%~3.45%，自然海水的盐度最低，为2.6%[图1（b）]。除了B1的pH值为5.29（水呈酸性）外，其余水体pH值均为6.4~7.5[图1（b）]。循环水养殖系统的氨氮和亚硝酸盐氮含量差异明显，B1系统的氨氮含量最高，达到1 190 μg/L，但其亚硝酸盐氮含量较低，为10 μg/L；B2、C1系统和自然海水的氨氮含量较低，分别为20，30和30 μg/L，亚硝酸盐氮含量为10，10和3 μg/L[图1（c）]。总体来说，循环水养殖系统的溶解氧普遍低于自然海水，盐度和亚硝酸盐氮含量均高于自然海水，同时其pH值都低于自然海水，而大部分循环水养殖系统的氨氮含量高于自然海水。

图1 循环水养殖系统和自然海水中环境因子的变化

2.2 养殖水体和自然海水中细菌数量变化特征

各个循环水养殖系统的细菌种类和数量见图2（a）（b）（c）。由图2可见，各个循环水养殖系统的细菌数量高于自然海水。其中系统A2中异养细菌数最高，而系统A1、C1、C3较低。虽然A1和A2共用一类循环水系统，但A1中的异养细菌数比A2的异养细菌数高出1个数量级[图2（a）]，推测此差异是与鱼体的放养密度和鱼体自身的进食情况有关。而自然海水中致病菌的数量远远小于循环水养殖系统的数量。致病菌中弧菌的数量，在各个循环水养殖系统中的分布，基本处于同一个数量级，而自然海水中的弧菌数量比较少，少于循环水养殖系统一个数量级。此外，循环水养殖系统大肠菌群数量级远远高于自然海水中的大肠菌群。其中A1和A2系统中大肠菌群数量最高，远远高于其他养殖系统，其所检测弧菌的数量也高[图2（b）]。由图2（c）可以看出，氨化细菌和硫酸盐还原菌的数量分布差异明显。其中氨化细菌数在系统A1和系统B1的分布较多，分别为1.46×105和1.48×105CFU/mL；系统C1的氨化细菌数最少，为1.42×104CFU/mL，其硫酸盐还原菌数较氨化细菌数而言，低1～2个数量级。另外，系统C3的硫酸盐还原菌数最高，为8.1×103CFU/mL；系统C1的硫酸盐还原菌数最低，为5.0×102CFU/mL[图2（c）]。

图2 循环水养殖系统和自然海水中细菌数量的变化

3 讨论

水体微生物，对水产养殖环境具有生物修复作用。异养细菌是养殖生态系统的营养源，能够将各类型的有机物质分解成无机物，并且从中获得所需的养分和能量。异养细菌与养殖水体的理化因子有密切联系，其数量分布受水体温度、有机质含量、营养盐浓度等影响[12]，可通过测量其含量，来监测养殖系统的水质。本研究中，循环水养殖系统A1、A2、B1和C2的氨氮含量较高，其所检测出的异养细菌的数量也高。此外，通过对比海域营养型分级标准[13]，发现本研究的循环水养殖系统的水体处于腐水状态。由于水体的氨氮含量过高，导致水体营养过剩，进而引起异养细菌大量繁殖。本研究结果表明，A2系统的异养细菌数高达1.01×106CFU/mL，异养细菌数较高，可能与养殖过程中石斑鱼的排泄物和剩饵的不断积累有关。

一些弧菌和大肠菌群是水产养殖过程中的致病菌，因此在养殖过程中需要对这2类菌进行监测，如果这两者数量较大，说明养殖动物存在暴发疾病的危险[7]。文献[8]研究发现，弧菌数量的变化与水温的变化趋势相同，在8月份中旬达到全年最高值，此时弧菌数量会超过异养细菌数量。本研究中弧菌的数量相对较高，达到7.45×104CFU/mL，可能是由于取样时为9 月下旬，水温仍然较高，弧菌大量繁殖。

氨化细菌、硫酸盐还原菌是养殖水环境中与营养盐转化关系甚为密切的微生物类群，其酶解作用，可以将养殖环境中的有机氮、硫酸盐等转化或分解，对水环境起到一定的“缓冲”作用，有益于养殖水体的自净。然而，氨化细菌将含氮有机化合物（主要是蛋白质）降解后，再将其脱氨基转变为氨气（NH3）[7]；硫酸盐还原菌，是通过异化作用进行硫酸盐还原的一类厌氧细菌，它对水体的污染，是由于水体中硫酸盐和有机物的积累而引起，有机物的大量积累，增加了水体的化学需氧量，从而增加了氧气的消耗，使水体处于厌氧状态，因此有利于硫酸盐还原菌的大量繁殖，产生大量的硫化氢（H2S）[13-15]；这 2 类产物均对养殖鱼有毒性。若养殖水体中NH3和H2S含量较高，会污染水体，从而影响鱼类的正常生长。本研究结果显示，循环水养殖系统中B1 的这3 类细菌的数量，均高于其他养殖系统；水体的理化指标的测定结果也显示，系统B1 的水体是处于低氧、氨氮值较高的状态。而氨氮含量过高，又会影响鱼类摄食量，导致剩余过多的饵料，增加水体中有机物的含量，致使细菌大量繁殖。

养殖密度的增加，会产生大量的剩饵和水产动物排泄物，造成积累，水体会出现低氧、高氨氮和高亚硝酸盐氮现象，同时抗生素和化学药物的使用等综合因素，会导致水体污染和有害细菌增多。该研究结果显示，循环水养殖系统水体中异养细菌数、弧菌数、大肠菌群数、氨化细菌数和硫酸盐还原菌数均高于自然海水，并且水体呈腐水状态，表明养殖用水必须通过循环水养殖系统进行再净化后，才能重新进入循环水养殖池中。