基于胺响应的花青素水凝胶监测鱼/虾新鲜度的方法

富含蛋白质的水产品会由于温度、光照、湿度的变化和微生物的生长发生腐败，而轻微的腐败变质难以被察觉。水产品的腐败变质过程会产生氨和挥发性碱性含氮物质，导致pH值变化。花青素对pH值变化高度敏感，且随着pH值的改变能呈现出多种颜色变化，为开发基于颜色变化的质量指示方法奠定了重要基础。

湖南农业大学食品科学技术学院的董盛叶、石星波*和长沙矿冶院检测技术有限责任公司的符招弟*等人 制备了一种对生物胺响应的花青素功能水凝胶，可用于快速、便携、可视、无损监测鱼虾新鲜度，以琼脂糖为载体，以紫甘薯花青素（PSPA）为比色前体物，制成功能性水凝胶。选用三甲胺（TMA）作为食品腐败的指示物，验证PSPA水凝胶的质量指示功能。PSPA水凝胶的颜色通过智能手机采集，并使用Image J软件进行RGB分析得到数字化信息，以期为便携式现场即时检测食品新鲜度提供新的路径。

1 基于PSPA水凝胶监测新鲜度方法的建立

无损监测鱼/虾新鲜度的方法是基于PSPA结构会随着pH值的改变，发生由黄酮阳离子（红色）→甲醇假碱基（淡粉色）→醌基（蓝紫色）→查耳酮（黄绿色）等系列颜色转变而建立的（图1A）。以琼脂糖为载体，加入PSPA后冷却固化制备成功能水凝胶。鱼/虾腐败产生的TVB-N与水凝胶中的水作用形成碱性环境，使PSPA结构发生改变导致水凝胶发生肉眼可分辨的颜色变化，智能手机定时采集水凝胶的颜色并通过Image J进行RGB分析，得到颜色变化的数字化信息（图1B）。建立G/R值与挥发性胺浓度之间的关系，实现即时、无损监测鱼/虾新鲜度。

2 不同pH值的PSPA颜色和光谱变化

对PSPA在不同pH值缓冲溶液中的颜色变化进行测试，以确定其作为天然pH值指示剂的实际应用价值。如图2所示，pH 1.0～5.0时，PSPA溶液呈红色，吸光度随pH值的增加而降低（pH 2.0～5.0），此时PSPA主要是以黄酮阳离子的形式存在。pH 6.0～8.0时，转化为无色的甲醇假碱形式，溶液呈紫色且颜色逐渐变浅，紫外吸收峰发生红移且强度降低。pH 9.0～12.0时，PSPA结构转化为无色的甲醇假碱形式，从而使溶液颜色转变为蓝绿色。随着pH值进一步升高（pH 13.0～14.0），花青素被降解，结构遭到破坏，此时溶液呈现黄绿色/黄色，在524～612 nm波长范围内不再出现明显的紫外吸收峰。

3 基于功能水凝胶检测生物胺的可行性验证

如图3所示，加入TMA后PSPA溶液的颜色由玫红色变为绿色，且最大紫外吸收峰发生较大程度的红移（约70 nm）；当PSPA被添加到琼脂糖水凝胶中（图3B中曲线b），PSPA水凝胶的颜色依然保持玫红色，与TMA蒸气反应后呈现绿色，紫外吸收峰红移了约72 nm。这一结果表明，加入琼脂糖的PSPA依然具有与碱性气体发生反应的能力，可以应用于监测鱼/虾新鲜度。

4 PSPA水凝胶制备条件的优化

如图4所示，为了保证所制备的PSPA水凝胶具有最佳的胺类响应功能，对水凝胶中PSPA添加量、琼脂糖添加量、水凝胶厚度进行优化。图4A中，与TMA蒸气反应后的PSPA水凝胶的颜色数字化信息G/R值表明：PSPA添加量为12 mg/mL时有最佳的颜色响应，且随着PSPA质量浓度的增大，功能水凝胶不再表现出大的颜色差异。琼脂糖的浓度直接影响水凝胶整体结构的致密性，进而影响胺蒸气的渗入，图4B表明琼脂糖质量分数为0.4%有较好的比色效果，且在实际操作中发现琼脂质量分数低于0.3%的水凝胶稀软无法定型。水凝胶厚度是影响G/R准确性的关键所在，太薄的胶体拍照时容易散光且检测的线性范围缩小；胶体太厚致使上层水凝胶被反应，而下层依然保持反应前的本色，使采集信号时出现误差，图4C表明水凝胶厚度为3.0 mm时能够被TMA完全反应，且具有最佳的G/R值。因此，获得了制备PSPA水凝胶的最佳条件（PSPA质量浓度12 mg/mL；琼脂质量分数0.4%；水凝胶厚度3 mm）用于后续实验。

5 PSPA水凝胶检测TMA的灵敏度

为了研究PSPA水凝胶的灵敏度，将PSPA水凝胶盖扣在装有一系列不同浓度TMA的离心管上方，以模拟监测食物腐败过程。图5A表明，随着TMA蒸气浓度从0～194.22×10-9 mol/L范围内逐渐增加，与TMA反应后的PSPA水凝胶的最大紫外-可见吸收光谱发生红移的程度逐渐增大，最大红移程度可达到70 nm。相应的PSPA水凝胶的颜色由红色转变为蓝紫色再转变为黄绿色。当TMA蒸气超过97.01×10-9 mol/L时，水凝胶的颜色不再发生明显变化（图5B插图）。图5B中PSPA水凝胶对于TMA蒸气的响应信号被定义为与TAM反应后灰度值之比G/R。G/R值与TMA浓度在8.78×10-9～19.386×10-9 mol/L范围内具有良好的线性关系（图5B插图），回归方程为Y=0.023 6CTMA＋0.640 35（R2=0.992 1），检出限为0.84×10-9 mol/L。以上结果表明该便携式水凝胶能够有效定量检测TMA浓度，为监测实际样品的新鲜度提供良好的数据基础。

此外，PSPA水凝胶分别被保存在4 ℃和25 ℃的密封环境中保存28 d以考察其稳定性。如表1所示，与新鲜制备的PSPA水凝胶相比，该条件下保存的水凝胶经过TMA蒸气处理的颜色响应没有改变，表明PSPA水凝胶的胺响应能力至少可以稳定有效地保持一个月。PSPA水凝胶较强的稳定性，为开发商业化水产品新鲜度指示标签提供基础。

6 PSPA水凝胶对不同挥发性胺的响应

鱼虾腐败过程会产生多种不同种类的生物胺，因此还需要进一步考察PSPA水凝胶对其他挥发性胺的响应。选取TMA、DMA、TPA、HTA、TRA、β-PA、ELA 7 种代表性的生物胺为检测对象，评价结果如图6所示。插图的颜色变化和G/R信号表明PSPA水凝胶对不同种类的生物胺均有不同程度的响应。表明制备的功能水凝胶可以应用于实际样品新鲜度的监测。

7 PSPA水凝胶监测鱼/虾新鲜度

以鳙鱼和大明虾为实际样品，观察PSPA水凝胶在不同贮藏温度下监测样品新鲜度的实际应用性。如图7所示，PSPA水凝胶放置在装有样品的透明塑料盒中且与样品不接触。PSPA水凝胶的颜色变化与所监测样品的贮藏温度和时间相关。如图8A、B所示，PSPA水凝胶与20 g鱼/虾样品分别被放置在37、25、4 ℃条件下持续数小时或数天，水凝胶呈现出红色、淡紫色、蓝绿色、黄绿色等系列颜色变化，相比于鳙鱼（图8A），PSPA水凝胶对于大明虾（图8B）的监测所呈现出来的颜色变化更加丰富，这可能是由于样品之间的差异性所致。与此同时，可以清晰地观察到，4 ℃条件下PSPA水凝胶对于鱼/虾样品的监测所展示出的颜色转变更加丰富，说明该功能水凝胶更加适用于冷藏样品的监测。不同温度下监测鳙鱼新鲜度的PSPA水凝胶的G/R值变化曲线（图8C～E）表明，37 ℃贮藏6 h、25 ℃贮藏12 h、4 ℃贮藏3 d后G/R值急剧增加，水凝胶相对应的颜色转变趋势在图8A可以被观察到。监测大明虾的G/R值（图8F～H）表明，37 ℃贮藏3 h、25 ℃贮藏6 h、4 ℃贮藏2 d后G/R值急剧增加，这种加剧的趋势可以在图8B中体现。与此同时，对照实验（0 g样品，黑色曲线）在持续监测过程中的响应信号几乎不发生变化。以上结果表明，PSPA水凝胶能够很好地应用于不同温度下贮藏鱼/虾样品新鲜度的监测，且对4 ℃贮存样品的监测呈现的颜色变化更加丰富多元，为冷藏水产品的鲜度监测开辟了新的路径。

8 与传统检测鱼/虾新鲜度的方法对比

为了验证PSPA水凝胶监测鱼/虾样品新鲜度的方法的准确性，采用GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》中自动凯氏定氮仪法对20 g样品在37 ℃连续10 h产生的TVB-N含量进行测定，并将结果与PSPA水凝胶监测结果进行对比。如图9A、C所示，鱼（虾）样品的TVB-N含量在贮藏前4 h（5 h）均低于15 mg/100 g，说明此时样品新鲜可食用。鱼肉样品贮藏7 h后TVB-N含量达到21.09 mg/100 g，虾在37 ℃贮藏5 h后TVB-N含量20.13 mg/100g，超过了GB 2733—2015《鲜、冻动物性水产品》中所限定的推荐食用阈值（20 mg/100 g），说明此温度下贮藏超过7 h的鳙鱼和5 h的大明虾不推荐食用。从图9B、D可以看出，使用基于PSPA水凝胶的RGB法检测鱼（虾）新鲜度的G/R值与传统TVB-N法的结果线性拟合得到Pearson系数为0.998 4（0.996 6），说明本实验提出方法与TVB-N法检测结果存在明显相关性，且可以替代TVB-N法监测样品新鲜度。同时，根据图9B线性方程y=0.027 9x＋0.503 0，计算得到TVB-N含量为20 mg/100 g时，G/R值为1.061，该值可以用于判定鳙鱼样品不可被食用。同样的，根据图9D中y=0.012 24x＋0.622 4计算得到，当G/R值为0.867 2，大明虾样品也不可再食用。以上结果说明，基于PSPA水凝胶的RGB法能够在不破坏样品的条件下有效监测鱼/虾样品新鲜度，并识别样品可否食用，同时不需要大型精密仪器，具有简单、便携、无损的应用优势。

结论

本实验开发了一种基于生物胺响应的PSPA水凝胶，并结合RGB颜色分析方法监测鱼/虾新鲜度。该功能性水凝胶能很好地响应食品腐败指示物（TMA）和鱼、虾样品的新鲜度，其对TMA的检出限为0.84×10-9 mol/L。与传统检测鱼、虾新鲜度的TVB-N法相比，其Pearson系数分别达到0.998 4、0.996 6，验证了本方法的准确性。此外，PSPA水凝胶适用于监测不同温度下贮藏鱼、虾的新鲜度，且对4 ℃样品的监测表现出更加丰富的颜色转变。功能水凝胶、便携式手机和RGB分析法的结合，实现了可视化、数字化监测鱼、虾新鲜度。该方法成本低、检测速度快、便携，能满足现场即时检测的需求，其以监测挥发性胺类化合物为特点，普适性强，具有广阔的商业应用前景。