论文：鲢鳙放养对水体微生物碳源利用影响的围隔试验

鲢鳙放养对水体微生物碳源利用影响的围隔试验

刘其根，孙 宇，赵良杰，吴杰洋，张 真，胡忠军

(上海海洋大学农业部水产种质资源与利用重点开放实验室，上海， 201306)

利用Biolog技术就滆湖原位围隔内鲢鳙放养密度和比例对水体微生物碳源利用的影响进行了研究。结果显示，在试验阶段后期不同围隔内水体微生物对碳源总量的利用相对于试验中期有较明显的变化。未放养鲢鳙的对照组(A0)在试验后期对于碳源总量的利用低于各实验组(A1：鱼密度40 g/m3、鲢鳙比7∶3；A2∶40 g/m3、3∶7、A3∶80 g/m3、7∶3和A4∶80 g/m3、3∶7)。试验中期和后期，利用比例较高的碳源类型均为聚合物。主成分分析表明，试验后期不同围隔水体微生物群落碳代谢方式具有显著差异。其中，与主成分1显著相关的碳源主要有16种，分别属于聚合物、糖类、羧酸、氨基酸。实验中期和后期围隔水体微生物碳代谢多样性指数Shannon物种多样性指数、丰富度指数和Pielou均匀度指数均存在显著差异,代谢多样性指数最高的是实验组A1，实验组A4碳代谢多样性指数相对较低。根据鳙的绝对生物量、多样性指标以及对碳源的总量利用，可以得出以鲢鳙主导的微型生态系统中，鳙的绝对生物量对于水体微生物影响更加显著。

鲢鳙；围隔；微生物群落；功能多样性；Biolog

近年来，随着经济的高速发展，对环境的污染也在持续增加，大量的工业废水和生活污水排入湖泊，导致内陆湖泊严重的富营养化，进而造成蓝藻水华，对湖泊生态系统的结构和功能造成了不同程度的破坏。国内外，经典和非经典生物操纵技术常被用于富营养化湖泊过度增殖藻类的控制[1]。在国内，非经典生物操纵主要是通过放养滤食性鱼类鲢和鳙试图控制蓝藻水华[2]。鲢鳙将摄食的藻类转变成鱼体生物量，可有效地降低水体有机物的含量，从而达到改善水质的目的[3]。不同的湖泊由于其富营养化程度的差异，湖泊水文学、热力学状况以及鱼类群落结构的不同，鲢、鳙放养后的净化效果也不同，因此为达到其最佳生态效益，需要研究合理的鲢鳙比例和密度。目前该方面大部分的实验研究主要停留在鲢鳙放养对水体理化指标和浮游生物的影响上，而针对它们对微生物多样性影响方面的研究少见。

微生物在生态系统的物质循环和能量流动中起着关键性作用，微生物的分解能力尤其重要，其中包括转化有机质、腐殖化、降解污染物等功能，微生物群落多样性对维持生态环境的稳定起着重要作用[4-5]；研究人为放养滤食性鱼类是否会对水体中的微生物群落多样性产生影响，不仅有助于了解微生物的生命特征和环境适应机制，而且在治理湖泊富营养化方面具有重要的理论和现实意义。

Biolog技术是目前研究微生物功能多样性的常用方法，是由美国的BIOLOG公司于1989年开发成功，原理是微生物在利用碳源过程中产生的自由电子，与四唑盐染料发生还原显色反应，颜色的深浅可以反映微生物对碳源的利用程度。由于微生物对不同碳源的利用能力很大程度上取决于微生物的种类和固有性质，因此在一块微平板上同时测定微生物对不同单一碳源的利用能力，就可以鉴定纯种微生物或比较分析不同的微生物群落。这对于明确不同环境中微生物群落的作用具有重要意义[6-8]。本实验利用微生物的代谢活性来研究鲢、鳙不同放养比例和密度对水体中微生物碳源利用的影响[9-10]，以期为滆湖鲢鳙合理放养及为评价鲢鳙放养对水体的影响及认识其机理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

试验在江苏省滆湖北部湖区搭建的围隔内进行(图1)，北湖水域面积为15.9 km2，该湖区实施了疏浚工程，平均水深为3～4 m。实验围隔用高5 m×宽4 m×长6 m的PVC防水帆布制成，面积为24 m2，四边用若干毛竹固定，帆布上端与泡沫浮子(d1=30 cm)相连，底部与石龙(d2=15 cm)相连，围隔内套有大小相同的网箱，网眼为2 cm。实验用鲢鳙购于上海市崇明县水产良种场，鱼种体长14.5～16.2 cm，体重57.6～81.6 g。

图1 滆湖围隔样点图Fig.1 Site of enclosures in Gehu Lake

1.2 实验设计

滆湖台风一般出现在6-7月，且这两个月雨量较大，影响围隔的稳固性，另一方面滆湖的浮游植物在秋季(10月)有一个全年密度和生物量的高峰或次高峰[11]，因此把试验时间安排在2014年8月15日～2014年11月1日，共88 d。设置5个处理，包括无鱼空白对照处理(表1)，每个处理设置3个重复，试验期间不投喂任何饵料。

表1试验围隔鲢鳙放养比例和密度Tab.1 The stocking density and proportion of Chinese silver carp and bighead carp in experimental enclosures

1.3 样品采集与微生物群落功能多样性测定

在试验中期(2014年9月15日)和后期(2014年10月15日)用采水器在围隔的对角位置采集表层和中层水样，混合后装入已灭菌的塑料瓶中，将水样瓶放入低温保存箱内带回实验室，待测分析。

利用含有31种碳源底物的Biolog-Eco板(BiologInc，USA)研究分析微生物群落的功能多样性。在实验室内将水样样品静置10 min后，分别取150 μL水样接种至ECO板的每一个孔中，对照孔中加入150 μL的无菌水；将接种好的ECO板恒温(25℃)避光培养，并于0、24、48、72、96、120、144、168 h利用Biolog微生物全自动分析仪分别在590 nm和750 nm波长下测定光密度值[12-13]。6大类碳源的相对利用率等于某一类碳源AWCD的均值占6大类碳源总AWCD的百分比。

1.4 数据处理

2 结果

2.1 微生物群落代谢活性

观察各围隔水体微生物利用ECO板上全部碳源的AWCD可知(图2)，微生物利用碳源的总量随着培养时间的延长呈逐渐增加趋势，微生物群落AWCD值均在24 h后开始出现速率分化，中期开始时的分化速率要快于后期，随着培养时间的增加，后期微生物分化速率明显快于中期，曲线较中期更加陡峭(图2、图3)。试验中期不同围隔的AWCD规律并不明显，各实验组之间，以及与对照组之间没有呈现出一定的变化，并且曲线波动性较大，从整体趋势看，代谢活性从高到底依次排列为：A1>A4>A0>A3>A2(图2)；试验后期各个围隔的AWCD规律较为明显，对照组明显与其他实验组区分，且在72 h以后对照组AWCD处于最低水平。实验后期AWCD变化曲线更加平滑，每个时间点上微生物代谢活性高低排列基本为：A1>A3>A2>A4>A0(图3)。

图2 试验中期不同围隔微生物群落AWCD值变化Fig. 2 Variations of average well color development(AWCD) for microbial community in enclosures over time in the middle phase of experiment

图3 试验后期不同围隔微生物群落AWCD值变化Fig. 3 Variations of average well color development(AWCD) for microbial community in enclosures over time in the last phase of experiment

2.2 微生物碳源代谢多样性

试验中期和后期不同处理围隔间代谢多样性存在显著的差异(P<0.05)，中、后期不同围隔间三种指数高低趋势较为一致，均为A1最高，A4最低，且差异显著(P<0.05)。中后期比较而言，中期丰富度指数(S)高于后期，而多样性(H′)和均匀度(J)均低于后期。中、后期不同围隔间丰富度(S)、多样性(H′)和均匀度(J)大小排列分别为：A1>A0>A2>A3>A4、A1>A3>A2>A0>A4、A1>A3>A2>A0>A4，A1>A3>A2>A0>A4、A1>A2>A3>A0>A4、A1>A3>A2>A0>A4。

表2 试验中期微生物群落碳源代谢多样性指数处理间比较Tab.2 Comparison on diversity indices of carbon resources catabolism of microbial community among different stocking treatments in the middle phase of experiment

注：表中数据为平均值±标准(偏)差，n=3；不同字母代表差异显著，P<0.05。表3同。

表3 试验后期微生物群落碳源利用多样性试验处理间比较Tab.3 Comparison on diversity indices of carbon resources utilization of microbial community among different stocking treatments in the last phase of experiment

2.3 微生物群落对不同类型碳源的利用

Biolog-Eco板不同种类的碳源有31种，分为6大类，包括糖类10种，羧酸类7种，氨基酸类6 种，聚合物类4种，酚类、胺类各2种[16]。中、后期不同围隔水体微生物均对聚合物类利用率最高，且占比例在增加，由23.45%上升至28.62%；中期所有围隔对于其它碳源的利用率低于聚合物类的有氨基酸类(18.83%)、胺类(16.14%)、糖类(14.52%)、酚类(14.29%)，对羧酸类(12.77%)的利用率最低。后期所有围隔对碳源利用率低于聚合物类的有糖类(17.67%)、氨类(17.08%)和胺类(15.49%)，对羧酸类(11.10%)和酚类(10.04%)利用率最低。在实验后期，不同围隔间水体微生物对于羧酸类的利用存在显著差异(P<0.05)。除此之外，实验中后期不同处理间水体微生物对各种碳源的利用无显著差异(P>0.05)。

图3 试验中期微生物群落对6类碳源的相对利用率Fig.3 Relative use efficiency of 6 kinds of carbon sources by microbial community of different treatmens in the middle phase of experiment

图4 试验后期微生物群落对6类碳源的相对利用率Fig.4 Relative use efficiency of carbon sources by microbial community of different treatmens in the last phase of experiment

2.4 主成份分析

从微生物群落对31种碳源利用的主成份分析结果表明，各实验组(A1、A2、A3和A4)间微生物群落碳源利用方式实验中期(图5)差异并不十分显著，大致可分为三组，即试验组A1和A2为一组，试验组A3和A4为一组，对照组A0明显与其他实验组区分。实验后期(图6)差异显著(P<0.05)，可以分为A1、A2和A3为一组，实验组A4单独为一组，对照组A0仍与其他实验组显著区分。主成分得分系数方差分析的结果发现，仅实验后期水体微生物主成分1和主成分2得分系数存在显著差异(P<0.05)。水体微生物PC1得分系数差异表现在：A0组、A4组与A1、A2、A3组之间有显著差异，PC2得分系数差异表现在：A4组，A0组，A1、A2、A3组三者之间有显著差异(图6)。

图5 试验中期不同围隔间微生物碳源利用类型的主成分分析Fig.5 Principal components analysis (PCA) of variations of carbon utilization profiles of microbial communities in enclosure sites in the middle phase of experiment

图6 试验后期不同围隔间微生物碳源利用类型的主成分分析Fig.6 Principal components analysis (PCA) of variations of carbon utilization profiles of microbial communities in enclosure sites in the last phase of experiment

与试验后期主成分1、2具有较高相关系数(|r|>0.6)的碳源见表4，对PC1起主要作用的碳源主要有16种，分别属于聚合物(3种)、糖类(4种)、羧酸(5种)、氨基酸(4种)，说明有16种碳源使水体微生物群落碳代谢功能多样性在PC1上差异显著(P<0.05)；对PC2起主要作用的碳源主要有6种，分别属于聚合物(1种)、糖类(3种)、羧酸(1种)、氨基酸(1种)，说明有6种碳源使水体微生物群落碳代谢功能多样性在PC2上差异显著(P<0.05)。

表4 试验后期与主成分1、2显著相关的主要碳源(取│r│>0.6)Tab.4 The main carbon source significantly correlated with PC1 and PC2 in PCA in the last phase of experiment

续表1

3 讨论

本研究以Biolog技术为手段[17-19]，对滆湖原位围隔不同鲢鳙放养密度内水体微生物碳源利用的变化进行了探讨。研究发现，在试验后期，围隔微生物对碳源总量的利用规律明显。即随着鲢鳙放养量的增加围隔微生物代谢活性逐步降低，对照组明显与其他实验组区分，并且在72 h后对照组代谢活性处于最低水平。这说明鲢鳙的放养确实能够影响水体微生物对碳源的利用[20]。微生物群落多样性的指数是反映物种丰富度和均匀度的综合指标，其变化能够准确反映群落功能多样性总体的动态变化[21]。在本研究中，当把鲢和鳙的绝对生物量进行分开比较时，我们发现鳙的绝对生物量与各多样性指数呈现近似的变化趋势，即随着鳙的绝对生物量增加，各多样性指数基本呈现下降趋势。然而鲢的绝对生物量没有呈现出这种关联。表5是鲢、鳙绝对生物量在不同时期与各个多样性指数之间的相关系数。从表5我们可知，鲢的绝对生物量在试验中期和后期与各个多样性指数并没有显著相关。但是，鳙的绝对生物量在试验中期和后期与各个多样性指数之间呈现显著的负相关。结合表2和表3，鳙的绝对生物量和各个多样性指数总体上呈现出一定规律，但是丰富度中期鳙绝对生物量为24和28 g/m3以及多样性后期鳙绝对生物量为24和28 g/m3时，并没有十分严格的下降趋势，这可能是由于鳙的绝对生物量十分接近，围隔微型生态系统与放养对象的密度有直接的关联[1]，加之本实验为滆湖原位围隔实验操作难度较大，不可控因素较多。

表5 鲢、鳙绝对生物量在不同试验阶段与各个多样性指数之间的相关系数Tab.5 Correlation coefficient between the absolute biomass of bighead and silver carp and diversity indices in different phase of experiment

Biolog 的主成分分析是反映微生物群落功能结构特征的有效手段[22]。本实验通过对31种碳源利用的主成分分析发现，在试验后期不同围隔水体微生物群落碳源利用方式存在显著不同。在四个实验组当中，A4实验组明显与其他实验组区分开，观察不同碳源利用率的柱状图，也发现实验组A4的酚类和羧酸类相对利用率在四个实验组中是最低的，而聚合物和糖类是这四个组中是最高的。考虑到A4中鳙鱼的绝对生物是56 g/m3(其他三组分别为A1∶12 g/m3, A2∶28 g/m3, A3∶24 g/m3)，可以推测，在以鲢鳙主导的微型生态系统中，鳙的绝对生物量可能对微生物功能多样性有着更加明显的影响。造成这种现象的原因可能是因为相对于滆湖大环境，小型围隔系统较封闭，系统结构简单，加之鳙肠道内菌群对于水体微生物影响较大[23]。

综上所述，适当放养鲢鳙可以促进水体微生物代谢活性和多样性，并且在微型生态系统中，鳙对于水体微生物影响更明显。但由于本试验周期较短，加之微生物群落结构与功能多样性的复杂性，以及Biolog方法本身存在一定的局限性[17]，想要更加全面地揭示微生物的生态功能和鲢鳙对于水体微生物的影响，还需要结合其他的研究手段来进一步研究。

[1] Zhang X, Xie P, Huang X. A review of nontraditional biomanipulation.[J]. Sci World J, 2008, 8(1):1184-1196.

[2] 谢 平.鲢、鳙与藻类水华控制[M].北京:科学出版社,2003:1-134.

[3] 史为良，金文洪. 放养鲢、鳙对水体富营养化的影响[J]. 大连水产学院学报，1989，4(3)：11～23.

[4] Lemke M J，Brown B J，Leff L G. The response of three bacteria populations in a stream[J]. Microbial Ecol，1997，34：224～231.

[5] 张 偲，张长生，田新朋,等．中国海洋微生物多样性研究[J]．中国科学院院刊，2010，25(6)：651～658.

[6] 叶 飞, 宋存江, 陶 剑,等. 转基因棉花种植对根际土壤微生物群落功能多样性的影响[J]. 应用生态学报, 2010, 21(2):386-390.

[7] Kong X, Wang C, Ji M. Analysis of microbial metabolic characteristics in mesophilic and thermophilicbiofilters using Biolog plate technique [J]. Chem Engin J, 2013, 230(16):415-421.

[8] 华建峰, 林先贵, 蒋 倩,等. 砷矿区农田土壤微生物群落碳源代谢多样性[J]. 应用生态学报, 2013, 24(2):473-480.

[9] Ibekwe A M，Kennedy A C. Phospholipid fatty acid profiles and carbon utilizationpatterns for analysis of microbial community structure under field and greenhouse conditions[J]. FEMS Microbiol Ecol，1998，26：151-163.

[10] 王 强，戴九兰，吴大千,等. 微生物生态研究中基于BIOLOG方法的数据分析[J]. 生态学报，2010，30(3)：817～823.

[11] 陈立婧, 彭自然, 孔优佳,等. 江苏滆湖浮游藻类群落结构特征[J]. 生态学杂志, 2008, 27(9):1549-1556.

[12] 杨莺莺，李卓佳，梁晓华,等．芽胞杆菌对鱼池微生物群落代谢功能的影响[J]．微生物学杂志，2009, 29(3)：11-17.

[13] 展小云，吴冬秀，张 琳,等.小叶锦鸡儿根际微生物群落功能多样性对环境变化的响应[J]. 生态学报，2010，30(12)：3087～3097.

[14] Si C A B Ke H, St O, et al.Community-level physiological profiles of bacteria and fungi: plate type and incubation temperature influences on contrasting soils[J]. Fem Microbiol Ecol, 2003, 44(3):319-328.

[15] Connell S O, Lawson R D, Watwood M E, et al. Basic program for reduction of data from community-level physiological profiling using Biolog microplates: rationale and critical interpretation of data[J]. J Microbiol Method, 2000, 40(3):213-220.

[16] Reinertsen H, Jensen A, Koksvik J I, et al. Effects of fish removal on the limnetic ecosystem of a Eutrophic Lake[J].Can J Fish Aquat Sci, 1990, 47(1):166-173.

[17] 王 强, 戴九兰, 吴大千,等. 微生物生态研究中基于BIOLOG方法的数据分析[J]. 生态学报, 2010, 30(3):817-823.

[18] 岳冰冰, 李 鑫, 任芳菲,等.石油污染地土壤微生物群落的碳源利用特性[J]. 应用生态学报, 2011, 22(12):3259-3264.

[19] Singh M P．Application of Biolog FF MicroPlate for substrate utilization and metabolite profiling of closely related fungi[J]．J Microbiol Method，2009，77: 102-108.

[20] 祭仲石, 管卫兵, 苏孙国,等.太湖鲢鳙鱼肠道微生物群落结构及其多样性研究[A]//农业环境与生态安全—第五届全国农业环境科学学术研讨会论文集[C].2013.

[21] Garland J L. Analytical approaches to the characterization of samples of microbial communities using patterns of potential C source utilization[J]. Soil Biol Biochem, 1996, 28(2):213-221.

[22] 李 娟, 赵秉强, 李秀英,等.长期不同施肥制度下几种土壤微生物学特征变化[J]. 植物生态学报, 2008, 32(4):891-899.

[23] 唐永涛, 赵良杰, 杨 洋,等.基于16 S DNA比较研究混养三角帆蚌和鲢鳙对池塘养殖水体微生物群落结构的影响[J]. 淡水渔业, 2015,45(3):70-77.