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虾苗感染虾肝肠胞虫过程解析及防控建议

发表时间:2021/08/30 10:13:19  作者:shrimp  浏览次数:2550  
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一 、微孢子虫简介

微孢子虫(Microsporidia)是包括人类在内的其他真核生物的高度专业化的专性细胞内寄生虫,目前被认为是真菌的姐妹群(sister group),自19世纪第一次在家蚕中发现微孢子虫(Nosema bombycis),造成了养蚕业巨大的经济损失。它们在过去长期被认为是真核生物演化的一个早期阶段的遗迹,这个阶段是在生物获得线粒体之前,细胞内没有过氧化物酶体以及典型的高尔基体等真核生物特有的细胞器。但最近的研究工作使这个问题变得复杂了,因为研究人员发现,它们含有一个很小的线粒体残迹,被称为mitosome。Mitosome的功能还存在争议,但微孢子虫基因组已知编码线粒体铁-硫团结构的几个组分。现在,Golberg等人描述了两种微孢子虫的几个铁-硫团组分的克隆、定性和亚细胞定位。虽然一些组分定位于mitosome,但其他组分则是在胞质中,这便提出了关于它们的功能是怎样协调的问题。他们获得的数据支持这样一种观点:Mitosome的一个关键作用是在包括Nar1和Rli1在内的胞质铁-硫蛋白的生物合成中,它们对细胞生存至关重要。

二 、虾肝肠胞虫的发现及疫病流行

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)于2004年首次在泰国的斑节对虾(黑虎虾,Penaeus monodon)肝胰腺组织中被发现为一种未鉴定的微孢子虫,但直到2009年才被鉴定为新的物种,可引起斑节对虾养殖过程出现生长缓慢综合征(Monodon slow growth syndrome,MSGS),同时也是感染南美白对虾(Penaeus vannamei)的致病原,被感染后的对虾养殖过程中表现出生长速度缓慢、大小明显分化的肝胰腺微孢子虫病(Hepatopancreatic microsporidiosis,HPM)病症,对虾农养殖造成了严重的经济损失,因此,EHP是继白斑病(WSD)、急性肝胰腺坏死病(AHPND)后成为影响泰国对虾养殖第三个最棘手的问题。

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EHP 孢子扫描电镜观察结果

目前,众所周知,EHP在亚洲广泛存在(例如泰国、中国、印度、越南、印度尼西亚和马来西亚),最近委内瑞拉也有报道,已对全球对虾养殖产业构成威胁。通过共生及饲喂实验证明,EHP可通过养殖水体得以传播,以及经口摄食寄生EHP 的鲜活饵料、病虾、死虾而感染,即所谓的水平传播。而针对行业内宣称的EHP垂直传播,即通过亲虾传播给子代则缺乏系统科学证明,众所周知,EHP是一种专性、细胞内寄生的寄生虫,其进行细胞侵染时是需要一系列合适的条件才能进入细胞内部,普遍认为,在感染第一步EHP孢子壁上的蛋白(spore wall proteins,SWPs)与宿主细胞的糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)相互作用,然后在适合的条件下,极管通过挤压穿透宿主细胞膜,这个过程2毫秒内就能得以完成,最后极管作为导管将具感染性的孢子体转移到宿主细胞中,开始进入寄生细胞内的生命周期阶段。EHP最适合寄生的对虾肝胰腺组织为其增殖提供了条件,而侵染生殖细胞概率几乎为零,况且生殖细胞还要通过细胞分裂才能发育成熟,而引起人们普遍认为EHP可以垂直传播的缘故在于,对感染EHP的亲虾,其生产的无节幼体、虾苗几乎都检测出EHP阳性,但实质仍缺乏真正意义上的垂直传播验证实验。那我们该如何破解EHP垂直传播的疑惑呢?

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对虾混养感染模式图(摘自Paul Vinu Sa)

首先最容易想到的办法是,通过对亲虾产卵池中的受精卵进行收集清洗消毒,使受精卵表面的粘附物、微生物等得以清除,然后转移到新的孵化池中进行孵化生产,待发育到无节幼体后进行抽样检测。刚发育的无节幼体本身是一个封闭体,无口无肛门,与外界是相对隔离的,EHP是无法进入到无节幼体内部的,故引起EHP传播的途径必定是幼体表面粘附了亲虾产卵池水体中的孢子体,而孢子体则由亲虾排便带入。因此,我们通过生产实践中的“洗卵”操作、转移受精卵发育等方式是可以有效避免无节幼体携带EHP孢子体的风险,进而从幼体这一源头减少虾苗培育过程中EHP的感染。以上是一种有效处理预防EHP感染的方法,但是一旦确认亲虾感染了EHP,使用该方法则需要更多注意事项,各操作员工、工具、清洗消毒方法等都要做好全面的防范措施,最大限度控制因人为因素途径而传播EHP。

三 、虾肝肠胞虫与宿主相互作用机制

然而,关于EHP如何与宿主细胞相互作用的机制仍然不太清楚,为了更好的认识这一侵染过程,国外学者从EHP的全基因组测序入手,首次鉴定出了EHP的孢壁蛋白(EhSWP1),并利用其基因序列建立了一种更为特异的PCR检测方法,称为SWPPCR,其中扩增EhSWP1基因全长特异性引物为EHP_SWP01_F:5'–ATA TCCATG GGC ATG TTA GAA GAT GCA AAG-3'和EHP_SWP01_R:5'-ATA TCT CGA GAG AAA ATTTTT CAA GGT G-3'。通过对EhSWP1的功能结构描述,表明它包含三个肝素结合基序(HBMs)和一个二聚化生成弯曲的蛋白结构(BAR2结构域),其存在于成熟孢子壁的外孢子层和内孢子层中,并已被证明与肝素结合,这表明作为宿主细胞感染过程的早期步骤,它可能通过表面肝素与宿主细胞结合,并在毒害宿主细胞中起到重要作用。由此可见,我们可以假设,EHP使用这个识别过程来启动宿主细胞感染,寄希望这一理解可以为寻求、识别及攻击EHP脆弱的靶点,以发展预防和治疗方法来控制对虾养殖业的EHP。

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亚细胞定位(摘自Jaroenlak等)

为了侵入虾细胞,EHP必须接近虾肝胰腺小管上皮细胞,根据结果,假设EHP的孢子通过EhSWP1的3个HBMs中的带正电的残余物和细胞表面带负电的肝素之间的静电相互作用被上皮细胞吸引,一旦锚定,EHP孢子就会伸出极管,穿透宿主细胞膜,并将孢子体释放到宿主细胞质中,在宿主细胞质中发生下一个发育阶段。

虾苗感染虾肝肠胞虫过程解析及防控建议

示意模型(摘自Jaroenlak等)

四 、虾肝肠胞虫防控及建议

国内学者通过实时荧光定量PCR研究发现,肝胰腺中EHP载量在103copies/(ng Hp DNA)以上时,表现出较高的风险水平,且对虾EHP 的载量指数与对虾生长速率呈负相关,但在较低的差异范围内,EHP载量与对虾生长的相关性不明显。感染EHP的对虾,截止到目前还没有治疗该疾病的药物。因此养殖过程中需要认真关注重要的易感染环节,应该作为重点控制的对象,从亲虾的检测、苗种的检测、饲料的检测、饵料的控制、水体及对虾的疫情检测方面控制EHP的传播和发病。育种前用2.5%氢氧化钠溶液对所有育种工具进行消毒处理,保证虾苗为无特定病原(SPF)的苗种,养殖池塘塘底用生石灰充分消毒,放苗前对虾苗PCR检测确保不携带有EHP病原,饲料投喂方面要尽量避免投喂鲜活饵料,可以将鲜活饵料冰冻或者巴氏灭菌法处理后在进行投喂。行业更需要引起重视的是虾苗培育过程中的EHP防控,在高密度工厂化育苗过程中,虾苗感染EHP的几率和风险远远大于低密度的成虾养殖过程,且被EHP感染的虾苗极具威胁性,导致养殖成功率大打折扣,同时对养殖水平提出更高的要求,因此,作为养殖户选择虾苗的首要标准是无携带EHP病原的虾苗。

对检测确诊感染了EHP的虾苗,育苗企业应在育苗场进行无公害化处理,严禁虾苗流入市场,而对于养殖中的对虾而言,需养殖户日常根据虾苗的生活状态、生长速度及个体均匀度做初步判断,毕竟影响虾苗生长的因素太多了,要不要抽样进行EHP病原检测完全取决于养殖户自己。在国内养殖大虾应对EHP的影响时,业内有许多不同的观点与措施,意识并未趋于一致性,在养殖户眼中,虾塘中没有EHP肯定是最好不过的,但EHP的病原体无处不在,要想避免病原几乎是不可能,所以一般会采取一些特殊的养殖方式来应对疑似感染或已感染EHP的虾塘。EHP对大虾养殖中后期似乎没有太多威胁,因为它不会造成对虾大量死亡,而此时的养殖收益已经可以达到养殖盈亏平衡点了,养殖户采用轮补、疏塘等方式促进虾生长进而增加养殖收益。

总而言之,对虾育苗企业需要义不容辞地对虾苗EHP的安全担当与负责,坚持企业初心,为行业提供优质虾苗、良心虾苗,期待未来学者依据EHP侵染宿主的机制开发出一种预防及治疗EHP的方法。

部分参考文献

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