论文：重庆养殖场鳜群体微卫星遗传多样性研究

重庆养殖场鳜群体微卫星遗传多样性研究

范士琦，冯婧昀，苗晓敏，郭慧，陶怡曦，李云

（1.西南大学水产学院,渔业与水产生物技术实验室，重庆 400715；2.西南大学淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆市水产科学重点实验室，重庆 400715）

鳜（Siniperca chuatsi）俗称桂花鱼、翘嘴鳜，隶属于硬骨鱼纲（Osteichthyes），鲈形目（Perciformes），科（Serranidae），鳜亚科（Siniperinae），鳜属（Siniperca），广泛分布于中国长江和黑龙江水系及其附属湖泊水库以及朝鲜半岛、越南部分地区，为名贵水产品[1-3]。2020 年我国鳜养殖的总产量达37 万t，广东生产的鳜苗种占全国的95%以上[3]。鳜作为重要养殖鱼类，国内学者对其形态特征、养殖性能、种质资源、生理机能、遗传育种等方面开展了广泛研究[4-8]，取得了丰富的成果，目前已经报道的鳜新品种有“华康1 号”“长珠杂交鳜”“广清1号”“鼎鳜1 号”等[9-12]。尽管长江流域有着丰富的天然鳜种质资源，但位于长江上游的川渝地区鳜养殖产业起步较晚。近几年，重庆市鳜消费市场需求旺盛，鳜苗种需求持续增加，外购苗种质量不稳定，加上长途运输易产生应激反应，养殖风险大，制约了重庆鳜养殖业的发展[13]。

遗传多样性可以直接体现种群长期进化和发展中的遗传变异，因此开展鱼类遗传多样性的研究，可为了解鱼类的种质资源现状和遗传改良奠定基础[14-15]。微卫星标记技术是目前发展最快的一类分子标记，在鱼类遗传发育、DNA 指纹图谱制作分析、遗传连锁图谱构建和标记辅助选择中广泛使用[8]。微卫星DNA 在真核及原核生物基因组中被普遍应用，其特点相较于其他诸如RFLP、RAPD、AFLP 分子标记技术而言，多态性更高[16-17]。现通过微卫星DNA 遗传多样性，对重庆地区3 个养殖场的鳜群体的遗传多样性和遗传结构进行分析评价，拟为重庆鳜养殖种质资源调查提供基础数据，为优质苗种生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

活体鳜采自重庆市潼南区兴水养殖场（XS）、名优鱼养殖场（MY），以及重庆市巫溪县鳜养殖场（WX）。3 个群体样本的外部形态特征和可数性状标准均符合《鳜》（SC 1038—2000）的分类特征。各养殖场均随机采集样本50 尾，分别测量体高和体长。其中，MY 养殖场鳜平均体质量为（73.76±20.16）g，平均体长为（14.21±1.09）cm；XS 养殖场鳜平均体质量为（49.60±14.91）g，平均体长为（12.79±1.50）cm；WX 养殖场鳜平均体质量为（32.94±7.25）g，平均体长为（11.03±0.77）cm。捕捞后立即取尾鳍固定在95%乙醇中，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 微卫星DNA 标记

所有鳜样本基因组DNA 提取均采用酚-氯仿抽提法[18]。根据文献[19-21]，筛选出23 对鳜微卫星引物（由上海生工合成）。从3 个鳜群体中分别任选2 尾鳜的模板DNA 与23 对引物进行PCR 扩增筛选出10 对扩增效率高、多态性较好的引物（表1），并合成荧光基团标记引物（上海生工）。

表1 10 对荧光引物基本信息

其中，微卫星引物JX867997、JX867983、JX867992参考文献[20]，另外7 个引物参考文献[19，21]。10对引物的正向引物（5′端）添加HEX（蓝色）或FAM（绿色）或TAMRA（黑色）荧光标记，反向（3′端）不添加，然后分别与模板DNA 进行PCR 扩增反应。并通过ABI3730XL 遗传分析系统对产物进行STR 分型。

1.3 数据处理

采用Genemapper 软件，分析SSR 数据，统计分析包括等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、香农威纳指数（H′）、基因流（Nm）、基因分化系数（FST）等参数；哈迪温伯格平衡（Hardy-Weinberg）检验遗传距离和遗传相似系数；使用PIC_Calc 0.6 软件计算多态信息含量（PIC）。

2 结果与分析

2.1 群体遗传多样性

用10 个多态性好的微卫星引物共检测到95个等位基因（表2），Na为4～22，均值为9.5。就PIC而言，DQ789300 的多态性为中度（0.25＜PIC＜0.5）外，另外9 个多态性位点均有高度多态性（PIC＞0.5）。10 个微卫星位点FIS值为-0.390 9～0.146 9，FIT值为-0.339 4～0.188 6，平均值为-0.051 8；FST值为0.012 2～0.087 6。就Nm而言，除了DQ789391 的值＜4 外，其微卫星位点的Nm值均＞4。

表2 10 个微卫星位点的固定指数（F）和Nm①

筛选出的10 个微卫星位点在3 个鳜群体中的遗传多样性参数见表3。由表3 可见，鳜群体的Na均值为6.4～7.4，Ne均值为3.635～3.767，Ho均值为0.733～0.755，各群体He均值为0.674～0.711。3 个鳜群体I 均值为1.378～1.427，其中XS 群体最低，MY群体最高。

表3 3 个鳜群体微卫星遗传多样性参数①

2.2 群体遗传结构

3 个鳜群体间遗传相似系数（对角线上）和遗传距离（对角线下）见表4。由表4 可见，不同鳜群体间的遗传距离值为0.087 1～0.136 0，遗传相似系数值为0.889 5～0.916 6，＞0.05，其中MY 群体与XS 群体间相似系数值（0.916 6）高于MY 群体与WX 群体间遗传相似系数（0.872 8）。对重庆地区3 个鳜群体的分子方差分析结果表明（表5），95.44%的遗传变异来自个体内，4.47%的变异来自群体间，群体内变异组成为0.09%。

表4 3 个鳜群体间遗传相似系数（对角线上）和遗传距离（对角线下）

表5 3 个鳜群体的分子方差分析（AMOVA）

3 讨论

3.1 3 个鳜群体的遗传多样性

微卫星标记分析遗传多样性会受到种群样本量的影响，通常认为用于微卫星标记研究的样本量在≥20 个时，才能稳定反映出等位基因和有效基因数[22]。本试验的各群体的样本量为50 尾，可以反映出3 个鳜群体间的遗传变异程度。Buchanan 等[23]研究发现，高度多态表现为PIC＞0.5，中度多态时PIC值为0.25～0.50，而PIC＜0.5 时，则为低度多态；另外，微卫星位点选择标准是等位基因数在4 个以上[24]。本研究中，除了DQ789300 位点属于中度多态外，其余9 个微卫星位点的PIC 均在0.5 以上，属于高度多态；从Na来看，除DQ789300 外，其余微卫星位点的Na均≥4，能将群体遗传变异程度很好表现出来。

本研究所使用的微卫星位点所获得的遗传分析结果是可靠的，引物JX867983、JX867992 和JX86997，在150 个样本中观察到的等位基因数为7～11 个，低于文献[25]运用相同引物对3 种鳜属鱼类进行遗传分析所得到的等位基因数（11～19 个），这可能与本研究样本为同种样本有关。

本研究中，MY、XS、WX 群体的Na和Ne平均值分别为6.4，7.4，6.9 和3.675，3.635，3.767，不同群体之间差异较小。Na平均值与李珊[26]对清水江野生斑鳜群体的研究结果相差不大（Na=3.668 0）。Takezaki等[27]通过微卫星分析得出，群体间有遗传多样性表现在杂合度为0.3～0.8。MY、XS、WX 群体的平均Ho和He分别为0.733、0.755、0.736 和0.711、0.682、0.674，杂合度较高，群体变异丰富[18]。彭敏燕等[28]在对3 个鳜野生群体的微卫星遗传多样性研究中得出平均Ho和He分别为0.255 4～0.698 9 和0.710 0～0.744 6，低于本研究中群体结果平均Ho，稍高于本研究群体平均He值。从H′来看，各群体均值为1.378～1.427，高于梅秋兰等[29]对鳜原种群体和鳜群体使用微卫星技术研究得出的H′均值（1.078 和0.689）。本研究中，重庆市3 个鳜群体遗传多样性较高，提示3 个鳜养殖群体苗种来源的亲代繁育群体数量较大，遗传异质性较高，也反映出苗种产地人工选择压力小等原因[30]。

3.2 3 个鳜群体间的遗传结构

固定指数是研究遗传分化的重要指标，它包括FIT、FIS和FST3 种参数[31-32]。其中，FIS表示群体偏离随机交配的程度，当FIS＜0 认为群体在该位点存在杂合子过剩现象，FIS＞0，则表示杂合子缺失，FIS=0 时，即为达到平衡[33]。在本研究中，除了W19518、DQ789290、DQ789391 位点FIS＞0 外，其他位点的FIS均＜0，表明存在杂合子过剩，异交程度高。群体间的遗传分化程度可以通过FST揭示出来，分化程度较小时FST＜0.05，分化程度中等时为0.05～0.15，当FST＞0.15 时，表示群体间的分化程度高[34]。本研究中，有70%的微卫星位点的FST值均＜0.05，表明3 个群体间的分化程度低。针对Nm而言，一般认为如果Nm＞1，则表示不会有显著的遗传分化，当Nm＞4 时，则被认为分化程度很小[35]，本研究中，各位点的Nm均＞4，也证明3 个鳜群体间均未出现遗传分化现象。而根据AMOVA 来看，个体内部变异（95.44%）是遗传变异的最主要源头，群体间的变异程度仅占4.47%，这也符合FST得出的分析结果。

研究群体多样性的重要因素之一是遗传距离的大小，其与群体分化时间成正相关[36]。根据3 个鳜鱼群体间的遗传相似度、遗传距离数据，MY 群体与XS 群体遗传相似度最大（0.916 6），且遗传距离最短，而WX 群体与其他2 个群体的遗传相似度略小，遗传距离略大。文献[37]表明，同种间的群体遗传相似度为0.80～0.97，遗传距离为0.03～0.20。本研究结果显示，遗传相似度为0.872 8～0.916 6，遗传距离为0.087 1～0.136 0，可判定3 个群体为同一物种，且群体分化时间短。根据调查，XS、WX2 个群体苗种分别来源于广东清远、佛山，MY 群体属于重庆本地储养亲体的自繁苗种，其亲体从广东佛山引入，提示3 个群体的亲本可能来源于共同的祖代群体，也与广东鳜（翘嘴鳜）的养殖祖代群体于1980 年代引自长江中下游的历史相吻合[1，3]。

许多研究发现，养殖群体比野生群体发生瓶颈效应和种质同质化的可能性更大，这些都会导致遗传基因的丢失和群体遗传性的降低。在对来自湘江的野鲤养殖群体和野生群体的研究中发现，2 个群体间的遗传变异水平很大[38]；赵祥等[39]研究后发现，对比野生群体来看，黄姑鱼养殖群体的遗传多样性降低十分显著。在对鳜的遗传多样性研究中，方展强等[40]研究得出鳜养殖群体与野生群体之间遗传差异十分显著，养殖群体要显著低于野生群体；梅秋兰等[30]也基于微卫星对鳜养殖群体和原种群体的遗传差异进行了分析比较，得出鳜原种群体遗传多样性较为丰富的结论。因此，在原种场亲本群体和后备群体的选择时，选择遗传距离相对较远的亲本，并开展群体遗传多样性分析，对保持亲本群体的遗传多样性非常有必要性[41]。

4 结语

本研究运用微卫星标记对重庆3 个鳜养殖群体进行分析，结果表明，3 个鳜群体内的遗传多样性较高，群体间的遗传分化水平低，表明3 个群体内保留有较高的遗传异质性，群体间有较近的亲缘关系，反映了群体亲本源自共同的祖代。在生产中，要提高苗种质量、存活率和养殖性能，需加强亲本选育过程的遗传选择压力，提高已育成良种的生产力和覆盖率。